免疫组化（IHC）：从原理到应用的全面解读

免疫组化技术的原理与方法比较

一、免疫组化技术原理

免疫组化技术的核心原理是利用一抗特异性结合目标蛋白，再通过二抗进行信号放大，从而实现对目标蛋白的检测和定位。

二、按染色步骤分类

直接法（一步法）

原理：直接在二抗上标记酶（如辣根过氧化物酶，HRP），用于显色反应。

优点：操作简便，成本较低。

缺点：灵敏度较低，对于低丰度蛋白的检测效果不佳。

间接法（二步、三步或多步法）

原理：通过多步反应逐步放大信号，提高检测灵敏度。

优点：灵敏度显著提高。

缺点：操作步骤相对复杂。

 

三、按结合方式分类

抗原-抗体结合

过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法

原理：二抗标记HRP，再孵育能结合HRP的一抗。

优点：灵敏度较高。

缺点：非特异性增高，已逐渐被淘汰。

亲和连接

卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法

原理：二抗标记生物素，孵育后加入亲和素及标记HRP的生物素，通过聚合方式放大信号。

优点：灵敏度成倍提高。

缺点：非特异性增高。

链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法

原理：在亲和素上直接标记HRP，减少非特异性结合。

优点：灵敏度高，非特异性低，孵育时间短（通常10分钟）。

缺点：成本较高。

聚合物链接

即用型二步法

原理：在二抗上标记聚合的HRP，放大信号。

优点：灵敏度高，操作步骤简单。

缺点：成本较高。

适用范围：尤其适合内源性生物素含量高的组织抗原检测。

 

 

四、免疫荧光技术

免疫荧光技术主要采用以下方法进行信号放大：

直接法：操作简便，成本低，但灵敏度差。

LSAB法：灵敏度高，步骤相对简单。

三抗法：通过直接标记或LSAB标记的三抗进一步放大信号。

1. SP三步法操作流程

a. 脱蜡

• 步骤：将组织切片置于60℃恒温箱中20分钟，随后依次使用二甲苯I和二甲苯II各处理10分钟。
• 目的：去除切片中的石蜡，使后续试剂能够充分接触组织。

b. 梯度水化

• 步骤：依次使用100%乙醇I、100%乙醇II、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇，每种浓度处理3-5分钟。
• 目的：逐步降低乙醇浓度，使组织切片从脱蜡状态恢复到水化状态，为后续处理做好准备。

c. 灭活内源性过氧化物酶

• 步骤：在常温下，使用3%过氧化氢溶液避光孵育10分钟，随后用PBS缓冲液冲洗3次，每次3分钟。
• 目的：消除内源性过氧化物酶的活性，防止其干扰后续的免疫组化反应。

d. 抗原修复

• 步骤：将切片置于0.01M枸橼酸缓冲液（pH 6.0）中，使用微波炉高火加热4次，每次6分钟，自然冷却30分钟以上，至室温后用PBS缓冲液冲洗3次，每次3分钟。
• 目的：通过加热使固定过程中封闭的抗原决定簇重新暴露，提高抗原检测率。

e. 封闭

• 步骤：使用封闭液（一般与二抗来源一致，如正常羊血清工作液）封闭切片，常温下孵育10-30分钟，倾去封闭液，勿洗。
• 目的：封闭组织切片上的非特异性结合位点，减少背景染色。

f. 一抗孵育

• 步骤：滴加适宜浓度的一抗，4℃冰箱孵育过夜（最常用），37℃复温45分钟，用PBS缓冲液冲洗5次，每次3分钟（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）。
• 目的：使一抗与组织中的目标抗原特异性结合。

g. 二抗孵育

• 步骤：滴加生物素标记的二抗，37℃孵育30分钟，用PBS缓冲液冲洗5次，每次3分钟。
• 目的：通过二抗与一抗结合，进一步放大信号。

h. SP反应

• 步骤：滴加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素工作液，37℃孵育30分钟，用PBS缓冲液冲洗5次，每次3分钟。
• 目的：通过链霉亲和素与生物素的高亲和力结合，进一步放大信号。

i. DAB显色

• 步骤：配置DAB/H₂O₂反应液，孵育组织切片，镜下控制显色时间，一般3-10分钟，自来水充分冲洗。
• 目的：通过DAB显色反应，使目标抗原显色，便于观察。

j. 苏木素复染

• 步骤：根据目标抗原的定位，胞浆蛋白或胞膜蛋白可适当染色几十秒至几分钟，胞核蛋白则染色几秒。若过染，可用1%盐酸褪色。
• 目的：形成细胞轮廓，便于对目标蛋白进行定位。

k. 常规脱水

• 步骤：依次使用50%、70%、95%、95%、100%、100%乙醇处理，每次1-2分钟。
• 目的：通过梯度脱水，使切片从水化状态恢复到脱水状态，为后续透明处理做好准备。

l. 透明

• 步骤：使用二甲苯I和二甲苯II各处理1-2分钟。
• 目的：使切片透明，便于后续封片和观察。

m. 封片

• 步骤：使用中性树胶封片。
• 目的：保护切片，防止切片干燥或损坏，便于长期保存和观察。

2. 免疫组化的关键环节

① 脱蜡和水化

• 目的：使后续试剂能够充分与组织中的抗原结合反应。
• 操作：脱蜡可先60℃处理20分钟，然后使用二甲苯处理1-3次，每次10分钟（具体时间根据二甲苯的新鲜程度和室温调整）。当天制好的切片一般先60℃处理3-4小时。水化则使用梯度乙醇（由高到低）。若脱蜡和水化不完全，易出现局灶性反应和浸洗不全，导致非特异性背景着色。

② 抗原修复

• 目的：通过抗原修复，使细胞内抗原决定簇重新暴露，提高抗原检测率。
• 方法：常用修复方法从强到弱分为高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种（中性的、高pH的等）。

③ 灭活内源性过氧化物酶和生物素

• 目的：防止内源性过氧化物酶和生物素干扰免疫组化反应。
• 操作：在传统ABC法和SP法中，使用3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，常温下处理10分钟左右；0.3%过氧化氢则可适当延长处理时间至10-30分钟。用甲醇配置过氧化氢比双蒸水或PBS更好，有助于保护抗原和固定组织。过氧化氢孵育时间过长易引起脱片，需现用现配，配好后4℃避光保存。

④ 血清封闭

• 目的：防止组织切片上的非特异性结合位点与一抗结合，造成假阳性结果。
• 操作：封闭血清一般与二抗来源一致，如正常羊血清工作液。血清中的抗体可预先与组织中有交叉反应的位点结合。也可使用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。一般室温孵育10-30分钟，但需防止封闭过度。

⑤ 一抗和二抗浓度和孵育时间

• 目的：确保一抗与目标抗原特异性结合，二抗与一抗有效结合，放大信号。
• 操作：一抗孵育条件是免疫组化反应中最关键的环节，包括孵育时间、温度和抗体浓度。一抗孵育温度有4℃、室温、37℃，其中4℃效果最佳。孵育时间与温度、抗体浓度有关，一般37℃孵育1-2小时，4℃过夜后37℃复温45分钟。二抗孵育条件一般为室温或37℃，30分钟-1小时，浓度一般有工作液。抗体稀释液一般使用PBS，专用抗体稀释液中还含有叠氮化钠防腐剂、BSA稳定剂等成分，有利于抗体的多次回收利用。

⑥ 切片清洗（浸洗、冲洗和漂洗）

• 目的：防止一抗、二抗等试剂残留引起非特异性染色。
• 操作：适当加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要。单独冲洗，防止交叉反应造成污染；温柔冲洗（浸洗方式），防止切片脱落；冲洗时间要足够，彻底洗去结合的物质。PBS的pH值建议在7.4-7.6，浓度为0.01M。中性及弱碱性条件（pH 7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解。

⑦ DAB显色

• 目的：通过DAB显色反应，使目标抗原显色，便于观察。
• 操作：背景的深浅和特异性染色的深浅均取决于DAB孵育条件。DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现特异性染色较强而本底着色较浅时即可冲洗。DAB显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，可能说明抗体浓度过高或孵育时间过长，需下调抗体浓度或缩短孵育时间。若很短时间就出现背景很深，可能说明封闭非特异性蛋白不全，需延长封闭时间。DAB显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，可能说明抗体浓度过低或孵育时间过短，需增加抗体浓度或

1. 非特异性染色的原因及解决方法

① 抗体孵育时间过长、抗体浓度过高

• 原因：抗体孵育时间过长或抗体浓度过高，容易导致背景着色增加。
• 解决方法：通过缩短一抗或二抗的孵育时间、稀释抗体浓度来控制背景染色。

② 使用多克隆抗体

• 原因：使用多克隆抗体容易出现非特异性着色。
• 解决方法：建议尝试使用单克隆抗体，以减少非特异性结合。

③ 内源性过氧化物酶和生物素含量高

• 原因：肝脏、肾脏等组织（尤其是含血细胞多的组织）内源性过氧化物酶和生物素含量高，容易导致背景染色。
• 解决方法：通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色。

④ 非特异性组分与抗体结合

• 原因：非特异性组分与抗体结合，导致背景染色。
• 解决方法：延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间，并适当增加封闭液浓度，以增强封闭效果。

⑤ DAB孵育时间过长或浓度过高

• 原因：DAB孵育时间过长或浓度过高，容易导致背景染色。
• 解决方法：严格控制DAB孵育时间和浓度，确保在显微镜下观察到特异性染色较强而背景着色较浅时停止反应。

⑥ PBS冲洗不充分

• 原因：PBS冲洗不充分，残留抗体导致着色增强。
• 解决方法：在一抗、二抗和SP孵育后，务必充分冲洗切片，确保残留抗体被彻底洗去。

⑦ 标本染色过程中干片

• 原因：标本染色过程中出现干片，容易增强非特异性着色。
• 解决方法：保持标本湿润，避免干片现象的发生。

2. 呈阴性结果的原因及解决方法

① 抗体浓度和质量问题

• 原因：抗体浓度过高或过低，抗体质量问题，以及抗体来源选择错误。
• 解决方法：抗体浓度过高或过低均可能导致阴性结果，需摸索最佳抗体浓度。同时，确保抗体质量可靠，选择合适的抗体来源。

② 抗原修复不全

• 原因：抗原修复不充分，特别是甲醛固定的组织，抗原表位未充分暴露，影响抗体结合。
• 解决方法：对于甲醛固定的组织，必须进行充分的抗原修复，以打开抗原表位，便于抗体结合。

③ 组织切片抗原含量低

• 原因：组织切片本身抗原含量低，导致检测不到阳性信号。
• 解决方法：确保组织切片质量，必要时增加切片厚度或使用其他检测方法。

④ 血清封闭时间过长

• 原因：血清封闭时间过长，可能影响抗体与抗原的结合。
• 解决方法：控制血清封闭时间，避免过长封闭。

⑤ 细胞通透不全

• 原因：细胞通透处理不充分，抗体未能充分进入细胞内参与反应。
• 解决方法：优化细胞通透处理步骤，确保抗体能够充分进入细胞内与抗原结合。