Media formulation optimization: current and future opportunities
摘要
化学成分限定的细胞培养基是用于细胞代谢和生长的复杂分子混合物。确定培养基配方中包含哪些分子及其最佳浓度是生物生产中的一项关键任务。不同细胞系的细胞代谢复杂性以及严格的质量要求，使得培养基配方的优化需要耗费大量时间进行反复实验。培养基组分之间数量级浓度差异巨大，进一步加剧了培养基表征的困难。本综述详细描述了当前用于优化培养基配方所面临的挑战、取得的进展、采用的策略以及未来潜在的改进机会。
引言
细胞培养基在生物生产中扮演着至关重要的角色，因为它直接关系到细胞的生长、生产力以及产品质量。培养基中的成分可能会被整合到药物分子本身，从而影响药物的安全性和有效性。化学成分限定的培养基（CDM）由于其复杂性而极具挑战性。这种复杂性主要源于不同细胞系对培养基要求的不确定性、特定成分对不同细胞系影响的不确定性，以及培养基中成分的绝对数量（超过50种）。这些因素使得设计CDM并优化其成分浓度的过程变得极为困难。
例如，必需氨基酸的耗尽可能导致细胞在其他氨基酸位置进行替代，从而改变蛋白质的结构，进而影响法规注册。此外，生化辅助因子（如金属离子）对于细胞功能至关重要，其消耗或过量都可能导致细胞功能异常。另一个例子是，缺乏铜离子的培养基可能会抑制常见的代谢乳酸转移，阻碍细胞生长；而富含铜离子的培养基则可能导致高水平的蛋白质脱酰胺作用。
在设计CDM时，还需要考虑工艺问题。例如，浓缩组分以减少液体体积，防止在大工作体积中补料培养基出现高渗透压和溶解度问题。此外，高度浓缩的补料溶液可能会引起pH值波动，需要添加缓冲液，这又会加剧渗透压问题。这与灌流细胞培养中培养基配方的驱动因素相矛盾，因为在灌流细胞培养中，更倾向于使用更精简、成本更低的培养基。
CDM中组分的原材料也会对工艺、产品产量和产品质量产生影响，但这种影响尚未得到充分表征。结合前面讨论的所有培养基配方不确定性来源，甚至很难准确测量CDM中的所有组分。这主要是因为不同成分的浓度范围差异巨大，例如葡萄糖的浓度在1-10 mmol/L的数量级，而一些金属离子的浓度则在十亿分之一的水平。
每个单独的工艺都需要进行培养基配方优化。Pan等人证明，一个克隆的最佳培养基对另一个克隆并非最佳。当应用于克隆B时，克隆A的最佳培养基表现出的生产力仅为克隆B最佳培养基的约70%。因此，培养基配方优化是工艺开发的关键部分。决定使用哪种策略来优化培养基配方取决于许多因素，例如产品类型、细胞类型和工艺类型。
当前的行业实践
目前存在几种启发式或行业实践方法，但尚无通用的培养基设计和优化方法。通常需要采用多种方法的组合来开发和优化培养基设计。Kennedy和Krouse将这些方法大致分为开放式和封闭式策略。封闭式策略涉及固定数量的已知培养基成分，并寻找它们的最佳浓度。然而，封闭式策略的主要缺点是无法发现可能有益的新组分。尽管如此，封闭式策略意味着优化过程可以更快地完成。
开放式策略则不对培养基组分的数量或特性加以限制。然而，在真正开放的方法中，需要研究的变量数量之多，使得培养基优化的任务几乎无法实现。因此，研究人员通常从一个固定的初始培养基开始，并进行与他们的细胞系和工艺密切相关的研究。关于其他组分及其潜在范围的选择则基于以往的工作，这样可以使任务的范围更加易于管理。
图一传统优化方法
（一）一次一变法
培养基设计的传统方法是“一次一变法”，即每次仅改变一个组分的浓度，通过多次迭代来优化所有组分的浓度。这种方法因其操作简便而被众多团队广泛采用。然而，随着研究的组分数量增加，实验工作量呈指数级增长，变得极为繁重。例如，对于10个组分，每个组分有5个浓度水平，就需要进行5¹⁰次实验，这显然是不切实际的。此外，这种方法的一个关键缺点是未能考虑组分之间的相互作用。例如，当组分B的浓度发生变化时，组分A的最佳浓度可能会有所不同。因此，即使通过这种方法可以得到改进的配方，也很难实现真正的优化。
（二）响应面方法（RSM）
实验设计（DoE）方法允许探索组分之间的交互作用，其中响应面方法（RSM）是一种广泛应用的DoE方法。RSM由Box和Wilson开发，已被成功用于为细菌、真菌和哺乳动物细胞设计培养基。一些研究人员已经使用中心复合设计（CCC或CCF）和RSM优化技术进行培养基优化，通过实验设计来确定培养基中关键组分的最佳浓度。这种方法不仅提高了优化效率，还减少了实验次数。
（三）培养基混合技术
培养基混合是一种用于同时优化多个培养基组分的常用技术。在这种方法中，通过将不同比例的现有培养基混合，根据培养基的性能对混合物进行排名。在混合过程中，培养基的组分应该是已知的并且有显著差异，以便最终的混合是独一无二的。然而，由于所有组分同时发生变化，这种方法无法得出因果关系的结论。尽管如此，与传统和DoE方法相比，培养基混合显著减少了优化的时间和成本。例如，Roullier等人使用高通量方法，在6周内通过培养基混合将工艺效价提高了40%。他们将包含相同47种成分的16种基础CDM混合，创建了376种独特的培养基配方，并收集到的数据被用来建立统计模型，以识别培养基中的关键组分部分。结果发现柠檬酸铁铵、泛酸、缬氨酸、蛋氨酸、精氨酸、生物素和丝氨酸是对效价影响最大的组分。
分析技术
（一）代谢物测量
有效的培养基配方需要准确的分析方法来测量培养期间的代谢物。通常，代谢分析仪（使用生物传感器和离子选择性电极的组合）用于测量大约10种主要代谢物和离子。为了测量其他组分，可以应用许多不同的技术，例如毛细管电泳（CE）、高效液相色谱（HPLC）、液相色谱与质谱联用（LCMS）、气相色谱（GC）和气相色谱质谱联用（GCMS）。
（二）GCMS和LCMS
GCMS可以为培养基配方应用提供有用的数据。例如，可以进行细胞内和细胞外代谢分析以跟踪某些培养基成分的使用情况以及识别限制性营养元素。来自GCMS的数据还与多变量数据分析相结合，以识别细胞健康的指标。虽然GCMS主要用于氨基酸，但也可用于定量脂质。对于脂质分析，需要脂肪酸甲酯（FAME）衍生步骤，之后可以使用GCMS鉴定脂质。LCMS还被用于分析哺乳动物细胞培养基中的细胞外代谢物，以及研究导致低生长速率和未能达到目标活细胞密度（VCD）的培养基批次。
（三）发酵组学
术语“发酵组学”用于定义使用核磁共振（NMR）的培养基分析，并已应用于测量培养基氨基酸浓度。NMR具有许多优点，包括简单的样品制备、非侵入性和非破坏性分析。NMR还可以统一观察所有有机分子，而无需衍生化。然而，基于色谱的方法提供了更高的准确性。
（四）基于同位素的代谢分析
基于同位素的代谢分析是一种有趣的方法，其中同位素用于跟踪途径和量化消耗的成分。这对于准确研究细胞如何使用培养基组分特别有用。例如，如果在谷氨酰胺中使用碳同位素，则产物分子中同位素的量表明谷氨酰胺在细胞新陈代谢中的使用方式。这是基于同位素的代谢分析的独特特征。
（五）整体分析方法
与其单独识别和测量组分，不如采用整体方法进行培养基分析和改进。DePalma开发了一种这样的方法，将培养基的荧光测量与MATLAB数据方差评估相结合，以找到光谱变化的来源。
（六）基因组学和转录组学
还进行了基因组学和转录组学研究，以通过改变培养温度、供应丁酸和诱导渗透压休克来增加产量。Griffin等人使用不同水平的基因表达来识别代谢变化。Millipore Sigma开发了一种有针对性的方法来寻找预期细胞会响应的培养基成分，从而消除了随机测试的需要。具体而言，采用高通量微阵列分析来筛选负责特定细胞系和过程中生长的细胞因子受体。然后可以筛选可以激活这些受体的培养基成分，并将其用于更有针对性的培养基优化研究。他们发现了四种可以激活培养基中受体的配体。该信息可用于围绕这四种成分设计一组更小的实验，以优化细胞生长。
未来的机会
（一）建模技术
建模一直是一个有吸引力的部分，因为它有可能取代实验室实验，或者至少显著减少所需的实验数量。模型只是将输出计算为给定输入的函数。如果模型输入是培养基组分，则可以优化配方以产生所需的输出。虽然还没有开发出正式的基于模型的方法（尽管可以说DoE方法是一种基于模型的方法），但值得简要介绍一下为生物生产过程开发的模型类型以及它们可能如何适用于培养基配方应用。
（二）化学计量模型
化学计量模型，如代谢通量分析（MFA）和通量平衡分析（FBA），将细胞内组分的通量分布估计为细胞外条件的函数，并作为约束方程组解的目标函数。虽然MFA和FBA是强大的建模工具，但一个主要缺点是它们仅提供假定稳态下的通量信息，因此无法预测瞬态培养行为。已实施化学计量模型来研究培养基补充如何影响代谢途径，并确定过量和限制所需途径的氨基酸。不难想象调整这些模型来制定培养基设计策略。例如，使用KEGG的CHO通路分析允许识别可能影响生长、生产力或产品质量属性（如糖基化）的特定感兴趣通路。然后可以使用化学计量模型来识别途径中与特定培养基成分相关的任何限制物质，然后根据提高生产率或最大限度地减少不需要的聚糖来优化培养基。在模型分析之后，只需要一些实验研究来验证结果。这显然优于培养基混合案例或高成本的使用376次运行的转录组学方法。
（三）动力学模型
动力学模型试图描述细胞外成分的动态产生和消耗，但不明确描述细胞内行为。它们相对于化学计量模型的优势在于能够预测培养过程中的动态行为，但代价是简化（或不存在）细胞内模型。已经开发出动力学模型，能够预测生产力作为细胞外成分的函数。由于系统的复杂性，模型参数的适用范围通常很小。然而，可以执行一个小的DoE来参数化模型，然后可以用来探索广泛的培养基组合设计空间，然后进行验证实验。
（四）理想情况展望
在理想情况下，化学计量模型能够识别给定产品分子和细胞系的所有关键培养基组分。然后将使用动力学模型在计算机上进行培养基配方优化。在此之后，将进行少量实验以确认培养基配方的行为符合预期。转向生产车间，分析技术的改进将允许在线或在线测量，这些测量将用作模型的输入，以便在生产过程中实时对培养基进行补充，以考虑原材料的可变性或任何其他工艺扰乱。虽然在短期内实现这种理想情况是不可行的，但值得记住的是，实现这种理想情况所需的支持技术已以此处讨论的某种方式全部用于培养基配方优化研究。
结束语与未来展望
精准定制细胞培养基以契合每个工艺中特定细胞系的需求，是生物生产领域中至关重要的一环。如前所述，不同细胞系乃至同一细胞系的不同克隆，皆需独特定制的培养基配方来达成性能优化。而工艺类型（诸如分批工艺、补料工艺与连续工艺）对培养基的要求更是大相径庭。在补料批培养中，补料培养基的强化与浓缩虽能提升效率，却也引发了沉淀问题；相对地，灌流培养则渴求更为精简、成本效益更高的补料培养基，以确保性能不致大幅下滑。
深入探究单个培养基组分对质量属性的潜在影响，其价值不容小觑。组学方法，凭借其强大的分析能力，有望构建起对细胞在不同环境下的行为机理的深刻理解。以转录组学为例，它能在多样化的培养基条件下捕捉基因表达的动态变化，进而推断出细胞通路及代谢通量的转变信息。这些珍贵信息，终将助力构建精准的机械模型，用以预测契合特定质量属性或达成既定生产率的最佳培养基成分。灵敏且精准的分析工具，搭配多属性方法，用于生成供模型参考的数据，将显著提升模型的准确性与可靠性。归根结底，全面且细致地描述所有单个培养基组分及其对质量和细胞行为的复杂影响，对于优化培养基配方而言，意义非凡。
展望未来，改进的分析方法、化学计量模型与动力学模型的有机融合，将成为获取培养基配方优化最佳结果的关键所在。在缺乏实验数据（或仅有有限数据集）的情况下，精准预测不同培养基配方对培养性能的潜在影响，其重要性无论如何强调都不为过。新兴的高通量方法，正以迅猛之势加速此类模型的开发与验证进程。随着技术的不断演进，有望实现利用在线或旁线过程分析技术（PAT），为车间的模型与控制器实时提供输入数据。这将彻底革新生产车间的补料培养基优化方式，从而免去数月繁琐的工艺开发流程，打造出一个从监管角度来看稳健可靠的生产工艺，为生物生产的高效、精准与可持续发展开辟全新道路。
| 名称 | 货号 | 规格 |
| HEK293细胞扩增培养基补料 | abs9826-100mL | 100mL |
| 免疫细胞无血清培养基 | abs9772-1L | 1L |
| 人脂肪干细胞无血清培养基(无酚红） | abs9420-500ml | 500ml |
| 人成纤维细胞无血清培养基 | abs9871-500mL | 500mL |
