3D培养用细胞因子
细胞培养是一种在人工环境中培育细胞的技术，旨在研究细胞对外部环境刺激的响应特性。目前，市场上存在多种类型的细胞培养方法，它们各自具有独特的性质和应用场景。在众多细胞培养技术中，3D细胞培养因其创新性和便捷性而日益受到青睐，相较于其他传统细胞培养方法，展现出显著的优势。
3D细胞培养技术可被定义为在微组装设备及特定载体中培育活细胞的过程。该技术能够使细胞形成三维结构，从而在一定程度上模拟组织和器官的特定微结构，为细胞研究提供了一个更为接近生理环境的平台。
1. 培养方法：2D VS 3D
1.1 2D 培养速览
在过去的几十年中，2D 培养技术作为一种传统的体外细胞研究方法，被广泛应用于多种类型的细胞研究以及药物筛选与测试。通常情况下，2D 培养系统允许细胞在聚酯或玻璃等平面基质上生长，为细胞的增殖提供了一个相对简单的物理环境。2D 细胞培养技术为生物学研究带来了诸多突破，但由于其结构的相对简单性，该模型无法精准地模拟体内复杂的微环境，包括细胞信号传导、化学梯度以及几何结构等。因此，基于 2D 细胞培养所获得的数据在应用于体内研究时，可能存在一定的误导性和不可预测性。鉴于此，近年来，科学家们开始将研究重点转向三维仿生细胞培养技术，该技术能够更加准确地反映细胞在体内生长的实际微环境。
1.2 3D 细胞培养：比较 3D 细胞培养与 2D 细胞培养的优缺点
3D 细胞培养技术具有多种类型，每种类型均具备独特的优缺点。与 2D 细胞培养相比，3D 细胞培养通过利用微组装结构和复杂的环境参数，有效促进了细胞分化和组织形成。在 3D 环境中生长的细胞，相较于 2D 环境中的细胞，更容易受到形态和生理变化的影响。这种现象主要归因于细胞支架的结构作用及其对细胞行为的引导。研究表明，细胞载体的几何形状和组成不仅能够影响基因表达，还能增强细胞间的相互沟通。例如，在 3D 细胞培养中，一些促进细胞增殖的基因被抑制，从而避免了 2D 细胞培养中常见的无序增殖现象。此外，3D 细胞培养还支持两种不同细胞群体的同时培养，与基于 2D 细胞培养的共培养相比，其能够更精准地复制组织内观察到的细胞功能。细胞间的相互作用是细胞功能的关键要素之一，这也是开展基质细胞（器官结缔组织）研究的重要原因，基质细胞在癌症发生和发展中发挥着重要作用。最后，3D 细胞培养技术借助微工程技术（如微流体技术），能够更便捷地控制和监测生长细胞的微环境参数，包括温度、化学梯度、氧气浓度、pH 值等，从而在一定程度上更接近体内实际环境。
人们必须认识到，3D 细胞培养作为一种新兴技术，目前仍处于发展阶段，其潜在的现象和意义尚未被研究人员完全掌握。尽管如此，这项技术已经展现出巨大的应用前景和研究价值。然而，不可忽视的是，3D 细胞培养技术目前仍存在一些明显的不足之处，但这些问题有望随着技术的不断进步而得到克服。
首先，部分支架基质中含有来自动物或其他潜在有害来源（如病毒、可溶性因子）的化合物，这些成分可能会对细胞培养产生干扰，影响实验结果的准确性和可靠性。此外，一些基质虽然能够为细胞提供良好的粘附性，但这也使得细胞的去除变得更加困难，增加了实验操作的复杂性和成本。其次，尽管 3D 细胞培养技术在一定程度上可以替代动物实验，从而节省药物试验的成本和时间，但开发自动化和可重复应用的 3D 细胞培养系统仍然是一个非常昂贵且复杂的过程，这在一定程度上限制了其广泛应用。
与传统的 2D 单层细胞培养相比，3D 细胞培养能够更精准地模拟体内细胞的行为和组织特性（包括形态和生理功能），是一种更为理想的体外研究模型。构建多层三维细胞结构通常需要借助支架，支架作为一种微组织的细胞载体，对细胞的分化和增殖具有显著影响。然而，由于 3D 细胞培养技术相对较新，其复杂的机制尚未被完全理解，因此在实际应用中仍面临诸多挑战。最后，为了进一步改进 3D 细胞培养技术，相关的应用开发需要投入大量的时间和资金，这也在一定程度上增加了技术推广的难度。
2.3D培养中的支架类型
支架是3D细胞培养中的关键支撑元素，根据不同的培养条件和预期目标，目前有多种类型的支架可供选择。
2.1 基于支架的3D培养技术
如上所述，支架在3D细胞培养中发挥着重要的支撑作用。由于其多孔性结构，支架能够有效地促进氧气、营养物质和废物的运输，为细胞的生长和代谢提供良好的微环境。细胞可以在支架的网状结构内增殖和迁移，并最终附着在支架上。随着细胞的不断生长，成熟的细胞之间会相互作用，逐渐形成与它们最初起源的组织相似的结构。在大多数情况下，这些细胞聚集体呈现为不同大小的球体，称为球体。这种细胞结构因其高度模拟体内组织的特性，常被用于药物筛选以及其他3D细胞培养应用。此外，使用支架的3D细胞培养能够提供更大的表面积，通常比不依赖支架的细胞培养具有更大的优势，从而为细胞的生长和研究提供了更广阔的空间。
2.2 其他类型的支架
如前所述，除了水凝胶之外，还有一些其他类型的支架可供选择，尽管其中绝大多数主要用于组织工程。其中一种材料是生物玻璃或生物陶瓷，这是一种可生物吸收的材料，能够提高新生组织的再生能力。另一方面，由于金属具有较高的抗压强度，尤其是优异的抗疲劳性，因此设计了主要由钛（Ti）和钽（Ta）制成的多孔金属支架。常用的非凝胶聚合物支架包括用于组织工程的天然聚合物，如胶原蛋白、纤维蛋白、海藻酸盐、丝绸、透明质酸和壳聚糖。合成聚合物则有聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）和聚己内酯（PCL）。这些聚合物因其产生的单体在植入时能够通过自然生理途径被移除而被优先选用。最后，复合材料也被用于搭建支架。它们由两种或两种以上截然不同的材料（例如陶瓷和聚合物的组合）构成，旨在利用这些材料的性能来满足机械和生理要求。
2.3 无支架三维细胞培养技术
为了产生球体，细胞聚集体作为一种良好的生理模型，也可以通过不依赖固体支撑（ECM 分子或生物材料）的 3D 培养技术来实现。使用这种技术获得的球体通常更小，且阻力更小。无支架三维细胞培养技术主要包括强制漂浮法、悬滴法和搅拌法。
-
强制漂浮法：该技术包括使用低附着力聚合物涂层的孔板。球体是在离心后用细胞悬浮液填充这些孔板而产生的。
-
悬滴法：这是 Kelm 等人采用的一种无支架技术，包括将细胞悬浮液等量放置在微孔微型托盘（Nunc）内。通过反转托盘，等分试样变成液滴，在其尖端呈现细胞聚集体，从而形成致密而均匀的球体。
-
搅拌法：使用生物反应器的基于搅拌的方法也可以作为一种简单的替代方法来获得三维球体。放置在旋转生物反应器中的细胞悬浮液逐渐将分离的细胞转变为聚集体，由于持续的搅拌，这些聚集体无法附着在容器壁上。结果，最终产生了范围广泛的非均匀椭球体。
支架是一种多孔性支撑物，用于调节细胞生长和增强信号传导。为了达到这一目的，它们促进了氧气、营养物质、可溶性因子和废物的运输，这要归功于它们旨在模拟体内组织结构的独特结构。目前制作的支架包括膜、基质，最重要的是具有优异性能的水凝胶。用于组织工程的支架与 3D 细胞培养中发现的支架不同，因为它们具有独特的特征，如生物降解性。最后，还可以使用无支架 3D 细胞培养技术来获得球体，包括强制漂浮法、悬滴法和搅拌法。
3.3D培养中的细胞特性
无论其来源如何，在3D细胞培养中生长的细胞均会呈现出特殊的外观，这取决于它们所模拟的组织类型。这些细胞展现出不同的属性和相互作用，具体如下所述。
3.1 3D培养：细胞大体形态
与2D细胞培养呈现单层结构不同，3D培养方法能够产生多层细胞聚集体（即球体），呈现出类似于体内观察到的复杂组织结构。如前文所述，这一成就主要归功于支架的构建作用，它使细胞能够形成这样的组织结构。最终，细胞的总体外观将取决于细胞类型，因为在3D培养中生长的上皮组织往往会形成极化的薄片，类似于皮肤表皮的结构。
3.2 3D培养：细胞间的相互作用
细胞与细胞之间以及细胞与基质之间的相互作用均为3D细胞培养中需要考虑的关键参数。细胞可以通过直接接触或化学作用相互作用并协同作用，以实现特定的目的。
首先，细胞间的通信是通过细胞连接实现的。细胞连接是由蛋白质组成的直接细胞间通道，形成了连接一个细胞与其邻居（或一个细胞与基质）的通道。此外，细胞因子或生长因子等分泌的可溶性因子可以通过直接接触或流动输送到邻近细胞和细胞外基质，形成由分子寿命决定的梯度。这些因子最终会与任何其他细胞（或用于自动调节的同一细胞）表达的受体结合，从而触发生理反应。此外，流向细胞外基质（ECM）的分子将被载体储存，并在需要时释放。
此外，细胞的生长和发育得益于细胞与基质之间的相互作用，这种相互作用对于细胞分化和生理功能至关重要（有助于更好地表达生物标志物和受体）。这种相互作用至关重要，因为生长细胞获得的一些特性只能通过支架对基因表达的影响及其对整个组织结构的支持作用来实现。
3.3 用于3D细胞培养的细胞的来源和性质
广泛的细胞类型可以被取样作为底物，以在3D培养中产生球体。在组织工程中，大多数时候需要特定类型的细胞群，如干细胞、自体细胞、同种异体细胞、异种细胞、祖细胞和多能细胞。同样，在3D培养中也使用这些细胞来获得球体。此外，这种培养方法还包括这些细胞类型的转基因变体，以及细胞系或动物来源的原代细胞。
由于担心免疫排斥，科学家们更倾向于使用自体细胞，或者在不得已的情况下使用同种异体细胞，尽管这些细胞也并非没有缺陷。事实上，在处理所有上述类型的细胞时，人们应该意识到以下主要的不利因素：低可获得性（3D培养中大多数细胞类型的常见问题）、在体外增殖能力方面遇到的困难，以及缺乏临床应用。然而，与其他类型的细胞不同，祖细胞和多能细胞显示出有希望的结果，因为它们没有受到前面提到的所有限制的负担。事实上，它们能够分化为不同谱系的能力是许多科学家深入研究的一个令人震惊的属性。研究人员正在努力在体外控制这一过程，因为干细胞在体内和体外的生长存在巨大差异。干细胞可以被诱导为体内分化的多能干细胞（IPS）。它们也可以从胰腺、心血管系统、脑、肺、肝、脂肪组织和骨髓等大量组织中分离出来。
在3D细胞培养中生长的细胞可以是干细胞、自体细胞、同种异体细胞、异种细胞、祖细胞和多能细胞。这些细胞形成称为球体的多层聚集体，展现出类似组织的结构，由于它们在结构上接近体内器官组织，因此在许多应用中被使用。最后，通过细胞连接和可溶性因子，可以观察到细胞与细胞之间或细胞与基质之间的直接和间接相互作用。
4.3D细胞培养应用
作为一种能够在反映活体条件的环境中研究细胞行为的工具，3D细胞培养提供了诸多应用。以下是一些最著名且最有用的应用方法。
4.1 组织工程中的三维细胞培养
近年来，3D细胞培养在组织工程领域取得了重大突破，为普通患者及个别患者提供了组织修复的替代方案。组织再生与重建有望从3D细胞培养中获益匪浅。事实上，与使用生物材料相比，3D培养中可利用微结构纤维支架（例如用于皮肤重建的上皮真皮）来生成人体组织。然而，组织工程可能成本高昂，且在一些国家，该应用的监管尚未明确。尽管如此，3D培养依然是进行干细胞和细胞分化研究的可靠方法。如今，了解复杂的机制，如成骨细胞如何转变为骨细胞，已成为可能且可重复。在此情况下，成骨可通过干细胞表达I型胶原标记物（如CBFA-1、碱性磷酸酶、骨联素、骨桥蛋白和JNK2）来触发。因此，具有所需特性的细胞可被注射至骨骼病变内，以重建受损组织。
4.2 微流控三维细胞培养：器官芯片
随着微流控技术的发展，其能够精确控制微环境参数，利用生物兼容的微流控芯片建立了长期可控的3D细胞培养模型，为组织的操作与研究提供了便利。这些芯片上的器官是仿生系统，通过模仿器官的微观结构、动态机械特性和生化功能，复制活器官的关键功能。器官芯片通过改进现有方法并带来新的可能性，改变了3D细胞培养的方式。
为了更好地复制活组织的组织和功能，由胶原蛋白或聚合物基膜制成的微结构被构建在芯片微通道内。与传统3D细胞培养不同，这些结构实际上能够重建在体内观察到的功能。例如，人类呼吸的肺器官芯片就是肺泡毛细血管的模型。它集成了一层柔性聚合物膜，能够像在活人肺内一样运动。微流控技术使芯片上的器官能够在不同尺度上进行精确的流动控制，以“灌溉”细胞培养。因此，为细胞提供必要的营养和其他元素，创造时空梯度成为可能。器官芯片还可促进创建分隔的微流控系统，从而实现受控共培养并重建组织 - 组织界面。因此，许多疾病模型得以发展，例如在恶性乳腺肿瘤和脑肿瘤的情况下，不同组织类型之间的沟通，或者当乳腺癌细胞成为浸润性癌时的行为。这项新技术完美地满足了复杂且挑剔的3D细胞培养要求。事实上，它有助于模拟组织界面以模拟器官功能，同时彻底监控和调节微环境（化学信号、流体流动、机械现象）。作为三维细胞培养的宿主，微通道连接到流经其中的流体混合的孔。这些通道由微流控输出设备（流量测量和控制系统）精确控制，这些设备调节微环境中的流量。通过使用微流控芯片，微通道内的受控细胞生长由提供足够的机械、化学和表面特性的适当载体引导。归根结底，通过芯片上的器官获得的结果是组织良好的组织，更能代表体内器官结构及其过程。由于这种节省时间的仿生模型，药物开发研究得以轻松进行，以便在器官尺度或系统尺度（芯片上的多个器官）上研究人类的生理反应。
4.3 3D细胞培养在药物检测中的应用
药物发现研究通常使用动物模型进行，已有30多年的历史。起初，这种做法在制药行业是一项可管理的例行任务。然而，随着时间的推移，可用的药物分子越多，高通量药物筛选就变得越昂贵，进行这些测试所需的时间也就越长。伴随着这一现象，引发了关于动物药物测试的伦理争议，这些测试甚至没有很好地转化为人类应用。从那时起，3D培养通过提供与2D或动物细胞培养非常相似的体内反应在一定程度上解决了这些问题。事实上，一些研究表明，在3D培养中生长的细胞对药物治疗的抵抗力更强，而使用其他培养方法则显示出有希望的结果。
因此，3D细胞培养也可以被描述为一种用于药物筛选的成本效益/节省时间的培养技术，因为它极大地缩短了药物试验周期，同时使药物试验更精确或更有针对性。例如，使用微工程应用（芯片上的器官），癌症治疗正在变得更好，通过更精确地针对特定细胞类型、明确的生物机制、精确的受体等来改善收益 - 风险平衡。不幸的是，仍然有太多药物测试由于无法提供无进展生存而不断失败。事实上，尽管3D细胞培养产生的组织与实际的自然组织之间可能更接近活体，但仍存在差距。
关于3D细胞培养的结论
细胞在三维环境中自然生长、成熟和分化。使用3D培养是在体外重现这一过程的准确方法。这就是为什么科学家们一直在研究广泛的细胞类型，包括干细胞、自体细胞、同种细胞、异种细胞、祖细胞和多能细胞。与2D单层细胞培养不同，3D细胞培养模型几乎可以完美地模拟体内细胞的行为和组织（形态和生理）。可以通过使用支架或无支架的方法来组装多层3D单元结构。无论是否使用支架，由于细胞连接和可溶性因子的作用，构成球体的细胞可以通过直接和间接的相互作用在自身和基质/载体之间相互作用。如今，组织工程等许多应用都源于3D细胞培养，这也得益于微流控芯片器官的出现，这也有助于改进药物测试。然而，随着3D细胞培养的科学家们仍在努力掌握其中的诀窍。
| 名称 | 货号 | 规格 |
| 3D培养试剂盒 | bulk-b3d-EA | EA |
| NK细胞因子套装 | UA090036-kit | kit |
| rhFGF basic/FGF2/bFG (25 ug) | 233-FB-025 | 25ug |
| rhWnt-3a (10 ug) | 5036-WN-010 | 10ug |
