通过《活细胞染色全攻略》大家可以根据研究对象选择好我们所需要的染料或者探针,关于染色步骤,小优也有宝典~。如果是肌动蛋白的染色步骤,大家可以参考《肌动蛋白Actin染色步骤详解》。微管蛋白tubulin的染色和肌动蛋白类似,今天小优会为大家详细介绍。
微管蛋白(Tubulin)由55 kDa的α-微管蛋白和β-微管蛋白异二聚体组成。微管蛋白聚合形成微管,并在细胞结构、细胞内运输和有丝分裂中发挥重要作用。
Cytoskeleton作为细胞骨架和小G蛋白研究专家,可提供全面的骨架蛋白染色试剂及方案。
一、固定细胞中的Tubulin的染色步骤
固定细胞中可以使用微管蛋白抗体进行Tubulin的染色。
01使用微管蛋白抗体(以Cat. #ANT02 ,Anti-Tubulin Polyclonal Ab (sheep host)为例)进行微管蛋白染色步骤
1) 取出含有细胞的盖玻片(细胞汇合度50%左右,可视细胞类型优化);
2) 弃去培养基,用PBS轻轻洗一次细胞(室温);
3) 将盖玻片转移到湿盒中,每张盖玻片上滴加100 µl固定液(甲醇),-20℃固定3min;
4) 用PBS轻轻冲洗细胞2次,每次30 s(室温);
5) 每张盖玻片上滴加100 µl通透剂(含1% Triton X-100的PBS),于湿盒中室温通透10 min;
6)移除通透剂,加入100 µl含3% BSA的PBS封闭缓冲液,孵育30分钟
7) 用PBS轻轻冲洗1次细胞,每次30 s(室温);
8) 每张盖玻片上滴加100-200 µl Anti-Tubulin Polyclonal Ab (sheep host)(1:500,封闭缓冲液稀释),于湿盒中室温孵育60 min或4℃过夜;
9) 使用含有1%Triton X-100的PBS轻轻冲洗细胞30 s;
10) 用PBST清洗盖玻片三次,每次孵育5 min(室温);
11) 每张盖玻片上滴加200 µl荧光二抗(稀释比例参考对应抗体说明书)于湿盒中室温孵育30 min(尽量减少光照);
12) 用PBS清洗盖玻片3次,每次5 min(室温);
13) (可选)每张盖玻片上滴加200 µl DAPI(稀释比例和孵育时间参考对应说明书),于湿盒中室温孵育5 min(尽量减少光照);
14) (可选)用PBS冲洗盖玻片3次,每次30 s(室温);
15) 用纸巾轻轻擦去盖玻片上的液体,然后倒置在载玻片上,滴一滴抗淬灭封片剂;
16) 静置20 min晾干,然后用指甲油封住每一面,4°C避光可保存24 h。
图2:使用微管蛋白抗体(ANT02)和DAPI通过IF检测Swiss 3T3 cells中的微管蛋白
文中部分相关产品:
货号 | 产品名称 |
ANT02 | Anti-Alpha/Beta Tubulin: Sheep Polyclonal |
二、活细胞中的Tubulin染色步骤
活细胞中可以使用荧光标记的微管蛋白、特殊的荧光探针(如SPY555-Tubulin Probe或SiR-Tubulin Kit)进行Tubulin的染色。
01显微注射荧光标记的微管蛋白(以Cat. #TL440M,Tubulin Protein (Fluorescent AMCA): Porcine Brain为例)进行微管蛋白染色步骤
1) 短暂离心,使荧光标记微管蛋白集中在小瓶底部;
2) 将荧光标记微管蛋白和无菌水置于冰上
3) 使用5ul冰的无菌水重悬荧光标记微管蛋白;
4) 将溶液吸入注射针中;
5)向细胞内注入0.25-0.5nl溶液;
6)在温控显微镜平台上使用较低强度的光和CCD摄像机观察细胞。
图3:AMCA标记的微管蛋白形成的微管
文中部分相关产品:
货号 | 产品名称 |
TL440M | Tubulin (AMCA dye labeled; porcine, micro-injctn) |
TL488M | Tubulin (HiLyte 488TM dye labeled; porcine, micro-injctn) |
TL590M | Tubulin (Rhodamine labeled; porcine, micro-injctn) |
TL670M | Tubulin (HiLyte 647TM dye labeled; porcine, micro-injctn) |
TL620M | Tubulin (X-rhodamine labeled; Porcine micr-injctn) |
02使用荧光探针(以Cat. #CY-SC203,SPY555-Tubulin Probe为例)进行微管蛋白染色步骤
1) 准备1000x储备液:向SPY555-Tubulin小瓶中加入50 µL无水DMSO,以制备1000倍储存液。建议使用新开封或新鲜的无水DMSO来制备此储存液,另外,不建议分装成小份(会造成化合物降解更快),另外该化合物不受多次冻融循环的影响;
2) 制备染色液:将SPY555-Tubulin稀释至1x于常用的细胞培养基中(例如含有10%胎牛血清的DMEM),并短暂涡旋混匀。如果稀释不是一步完成,请使用DMSO来制备中间稀释液,因为使用水性缓冲液会导致探针聚集;
3) 准备细胞及染色:当细胞达到所需的密度时,用染色液替换培养基,确保所有细胞都被覆盖,将细胞置于37°C、5%CO2的培养箱中,确定标记时间与探针浓度。
图3:Hela细胞使用SPY555-Tubulin染色的标记时间及探针使用浓度(不同细胞系可能会有所不同)
4)细胞成像:使用标准TMR或Cy3滤光片设置进行成像。染色完成后,可以直接对活细胞进行成像,无需清洗步骤。可选地,可以通过更换一次不含探针的新鲜培养基来简单清洗细胞,从而提高信噪比。如果需进行延时成像,建议在整个实验过程中保持探针在成像介质中,以获得稳定的信号。
图4:使用共焦显微镜与STED显微镜成像的SPY标记HeLa细胞比较。使用93X物镜成像,由Spirochrome公司提供。
文中部分相关产品:
货号 | 产品名称 |
CY-SC203 | SPY555-Tubulin Probe |
CY-SC503 | SPY650-Tubulin Probe |
CY-SC002 | SiR-Tubulin Kit |
CY-SC014 | SiR700-Tubulin Kit |