一、蛋白提取的总体步骤

（一）样本选择与处理

1. 体液样本：血浆、消化液和分泌液等体液中的可溶性蛋白质可以直接离心收集，无需额外的抽提步骤。这些样本中的蛋白质通常以游离形式存在，易于分离和纯化。
2. 细胞样本：
   • 悬浮细胞或细菌菌液：可直接离心收集，用于后续的蛋白提取。
   • 贴壁细胞：需先用PBS清洗，去除培养基和其他杂质后，再进行收集。
3. 组织样本：动物组织或手术标本必须新鲜处理。首先，取得实验所需的脏器或组织，剔除结缔组织及脂肪组织后，用预冷的生理盐水或PBS洗去血液或其他体液。对于某些脏器（如心脏、大脑、肝脏等），可采用灌注法洗去内部血液。处理后的组织需用滤纸吸去多余水分后收集待用。若不能立即进行实验，应将组织冻存于-80℃。

（二）细胞/组织的破碎与裂解

1. 研磨或匀浆：
   • 研钵研磨：适用于组织材料。将研钵置于冰上预冷，将组织及缓冲液放入后用力研磨成稠糊状。可加入氧化铝、石英砂及玻璃粉以进一步磨细，但需注意局部生热可能导致蛋白质变性或pH显著变化，且磨细剂的吸附可能导致蛋白质损失。研磨后离心取上清液。
   • 手持式电动匀浆器：多数为硬质塑料材质，通过钻头与EP管内壁的摩擦将组织磨碎。由于两面间隔较小，对细胞的破碎程度较高，且机械切力对分子的破坏较小。
   • 高通量组织破碎仪：加入适量的金属或玻璃等不同材质的珠子，通过机器高速敲击管壁震动使组织破碎。
2. 超声波处理法：利用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂。此法多适用于微生物材料。超声的频率和功率根据实验目的不同而调整，通常分为多个周期进行（如超声几秒，停几秒，反复多次）。超声的优点在于耗时短，肽链提取片段长度更可控，回收率更高。然而，超声过程中容易产生气泡并大量产热，需将容器置于冰上以避免过热。过强的超声波可能导致多聚物降解和蛋白失活，若出现沉淀则说明超声功率过大。
3. 反复冻融法：将样本在-20℃至-15℃下冻固后缓慢融化，反复操作使细胞及细胞内颗粒破坏。由于渗透压的变化，结合水冻结产生组织变性，冰晶碎片刺破细胞膜，使蛋白质可溶化。此方法成本低、操作简便，但过程缓慢，且不适用于对温度敏感的蛋白质。
4. 酶法：使用分解细胞壁或细胞膜成分的酶类使细胞破裂。例如，溶菌酶能专一性地破坏细菌细胞壁，水解糖肽组分的β-1,4-糖苷键，使细胞内含物释放出来，特别适用于革兰氏阳性细菌。
5. 有机溶剂法：将粉碎后的新鲜材料在0℃以下加入5 - 10倍量的丙酮，迅速搅拌均匀，可破坏细胞膜，使蛋白质与脂质分离。蛋白质一般不变性，脱脂和脱水后变为干燥粉末。用少量乙醚洗涤后，经滤纸干燥，如脱氢酶等可保存数月不失去活性。
6. 表面活性剂法：这是实验中相对常用的方法。常用的表面活性剂包括十二烷基磺酸钠（SDS）、氯化十二烷基吡啶及去氧胆酸钠等，非离子型表面活性剂如吐温40（Tween 40）或Triton X-100等，这些溶剂能破坏细胞膜使细胞瓦解，使蛋白质更易溶解。除去表面活性剂后，蛋白质仍留在上清液中。

（三）目的蛋白的提取

1. 水溶液提取法：
   • 提取条件优化：理想的提取条件应尽可能促进蛋白质在溶剂中的溶解，同时减弱蛋白水解酶的活力，以减少细胞的自溶过程。主要通过选择适当的pH、温度或溶剂，以及加入适当的蛋白水解酶抑制剂来实现。
   • 稀盐缓冲系统：稀盐缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大，是提取蛋白质最常用的溶剂。通常用量为原材料体积的1 - 5倍。提取时需均匀搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取温度应根据有效成分的性质确定。多数蛋白质的溶解度随温度升高而增大，但温度过高可能导致蛋白质变性失活。因此，提取蛋白质时一般采用低温（4℃以下）操作。为避免蛋白质在提取过程中降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸、碘乙酸等）。
   • pH选择：蛋白质是具有等电点的两性电解质，提取液的pH应选择在偏离等电点两侧的范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱导致蛋白质可解离基团发生变化，从而引起蛋白质构象的不可逆变化。一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。
   • 盐浓度选择：稀盐浓度可促进蛋白质的溶解，称为盐溶作用。同时，稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点。因此，在提取液中加入少量NaCl等中性盐（一般以0.15mol/L浓度为宜）可提高蛋白质的溶解度。缓冲液常采用0.02 - 0.05mol/L的磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。
2. 有机溶剂提取法：
   • 适用范围：一些与脂质结合牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂提取。这些溶剂具有一定的亲水性，同时具有较强的亲脂性，是理想的脂蛋白提取液，但必须在低温下操作。
   • 丁醇提取法的优势：丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质特别优越。首先，丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；其次，丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内不会引起蛋白质的变性失活。此外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，适用于动植物及微生物材料。

二、蛋白提取方法的优化策略

（一）蛋白提取方法的优化思路

1. 样本预处理的优化：
   • 新鲜样本处理：对于动物组织或手术标本，必须在获取后立即处理，以防止蛋白质降解。新鲜组织应在低温条件下（如4℃）进行操作，以减少蛋白酶的活性。对于某些脏器（如心脏、大脑、肝脏等），可采用灌注法洗去内部血液，减少杂质的干扰。
   • 样本保存：如果样本不能立即处理，应将其冻存于-80℃或液氮中。冻存前，样本应尽可能去除多余水分，以减少冰晶对细胞结构的破坏。
2. 细胞/组织破碎方法的选择与优化：
   • 机械破碎方法：如研磨、匀浆和超声波处理等，适用于大多数样本。但需注意破碎过程中产生的热量可能导致蛋白质变性。因此，破碎过程应在低温下进行，并尽量缩短操作时间。例如，超声波处理时，应将样本置于冰上，并控制超声功率和时间，以避免过度产热。
   • 酶法破碎：适用于细胞壁较坚韧的样本，如植物细胞和细菌。选择合适的酶（如溶菌酶）和反应条件，可以有效破碎细胞壁，同时减少对蛋白质的损伤。酶法破碎通常在温和的条件下进行，有助于保持蛋白质的活性。
   • 反复冻融法：适用于细胞壁较脆弱的样本，如某些微生物。该方法成本低、操作简便，但过程缓慢，且不适用于对温度敏感的蛋白质。在冻融过程中，应注意控制冻融次数和温度，以减少蛋白质的降解。
3. 提取液的选择与优化：
   • 缓冲液的选择：提取液的pH和离子强度对蛋白质的溶解度和稳定性有重要影响。一般来说，提取液的pH应选择在偏离蛋白质等电点两侧的范围内，以增加蛋白质的溶解度。同时，提取液中应加入适量的中性盐（如NaCl），以保护蛋白质不易变性。常用的缓冲液包括磷酸盐缓冲液（PBS）和碳酸盐缓冲液等。
   • 蛋白酶抑制剂的添加：在提取过程中，细胞内的蛋白酶会释放出来，导致蛋白质降解。因此，应在提取液中加入适量的蛋白酶抑制剂，如苯甲磺酰氟化物（PMSF）、碘乙酸等，以抑制蛋白酶的活性。此外，还可通过调整提取液的pH、温度或离子强度等条件，进一步优化蛋白质的提取效果。

（二）蛋白提取方法的优化实例

1. 细胞样本：
   • 贴壁细胞：用PBS清洗后，加入适量的裂解液（如RIPA裂解液），并加入蛋白酶抑制剂。在冰上孵育10 - 15分钟，期间轻轻摇动培养瓶，使裂解液充分作用于细胞。然后用细胞刮刀刮下细胞，转移至离心管中，12000g，4℃离心5分钟，取上清液用于后续实验。
   • 悬浮细胞：直接离心收集细胞，用PBS清洗后，加入裂解液和蛋白酶抑制剂，轻轻吹打混匀，冰上孵育10 - 15分钟，然后离心取上清液。
2. 组织样本：
   • 动物组织：将组织剪碎后，加入适量的提取液（如PBS或裂解液），用研钵研磨或匀浆器匀浆。研磨或匀浆过程中应置于冰上，以减少热量产生。研磨或匀浆完成后，12000g，4℃离心10分钟，取上清液。
   • 植物组织：将植物组织在液氮中研磨成粉末，加入适量的提取液，轻轻搅拌混匀，置于冰上静置30分钟，然后12000g，4℃离心15分钟，取上清液。
3. 体液样本：
   • 血浆、尿液等体液：可直接离心收集，去除杂质后，加入适量的提取液（如PBS或裂解液），轻轻吹打混匀，冰上孵育10 - 15分钟，然后离心取上清液。

（三）蛋白提取方法的优化建议

1. 预实验的重要性：在正式实验前，建议进行预实验，以确定最佳的提取条件。预实验可以帮助确定合适的裂解液、蛋白酶抑制剂、提取时间和温度等参数，从而提高蛋白提取的效率和质量。
2. 提取条件的优化：根据样本的特性和实验需求，优化提取条件。例如，对于需要保持蛋白质活性的实验，应选择温和的提取条件，如酶法破碎和低离子强度的提取液；对于需要大量提取蛋白质的实验，可选择高效的机械破碎方法和高浓度的裂解液。
3. 提取过程的监控：在提取过程中，应注意监控样本的状态，如颜色、粘度等。如果发现样本出现异常现象，如沉淀、变色等，应及时调整提取条件或重新进行提取。
4. 蛋白浓度和纯度的检测：提取完成后，应使用适当的方法检测蛋白浓度和纯度，如BCA法或Bradford法检测蛋白浓度，SDS-PAGE检测蛋白纯度。通过检测结果，可以评估提取方法的效果，并根据需要进行进一步的优化。

 

名称	货号	规格
液体样本蛋白提取试剂盒	abs50120-50T	50T
高尔基体蛋白提取试剂盒	abs50121-50T	50T
脑组织蛋白提取试剂盒	abs50114-50T	50T
全血蛋白提取试剂盒	abs50115-50T	50T