cfDNA
一、cfDNA 的定义与医学应用价值
血液中游离的 DNA，简称 cfDNA（circulating free DNA），是指循环血液中的核酸类物质，涵盖了循环血液中细胞内的核酸、游离的内源性脱氧核糖核酸以及外源性 DNA 与 RNA，如在真菌血症、细菌血症和病毒血症等病理情形下出现的血中外源核酸。cfDNA 在疾病的早期诊断、预后评估以及监测等方面展现出重要的潜在价值，其医学应用主要集中在以下三大领域：
（一）产前诊断
通过检测孕妇血液中的 cfDNA，可提前筛查胎儿的染色体异常等遗传性疾病，为产前诊断提供一种非侵入性的检测手段，降低传统侵入性产前诊断方法带来的风险。
（二）免疫性疾病等非肿瘤类疾病的病情分析与疗效观察
在免疫性疾病等非肿瘤类疾病的诊疗过程中，cfDNA 检测有助于实时监测疾病进展、评估治疗效果以及预测疾病复发风险，为临床医生制定个性化治疗方案提供参考依据。
（三）肿瘤相关分析
在肿瘤领域，cfDNA 分析的价值尤为突出。尽管目前血液中 cfDNA 分析尚未被列为临床必需的检测指标，但大量的研究论文以及众多一期和二期临床试验的数据，有力地证明了这一新技术在肿瘤防治中的巨大应用潜力。cfDNA 检测可用于肿瘤的早期筛查、诊断、治疗监测以及预后评估，为肿瘤患者的全程管理提供重要支持。
二、cfDNA 的来源
（一）外源的 DNA
包括病毒、细菌、真菌、饮食中含有的核酸等，这些外源性 DNA 可能因感染、炎症等病理生理过程进入血液循环，成为 cfDNA 的一部分。
（二）坏死
坏死是一种在细胞能量产生和再生功能丧失时发生的偶发性细胞死亡方式。细胞在坏死过程中会出现细胞器膨胀、碎裂，染色质融合以及非特异性消化等现象。与细胞程序性死亡相比，细胞坏死发生得更快，但由于其产生的 DNA 片段较大（约 10000bp），相较于程序性死亡产生的片段（约 140 - 200bp），坏死细胞更难从机体中清除。
（三）外伤和手术
外伤或手术的严重程度以及术后并发症与血浆 DNA 水平呈正相关。细胞死亡会导致血浆 DNA 水平升高，血清中 DNA 的浓度与手术前后某些酶浓度显著相关。在外伤过程中，mtDNA（线粒体 DNA）水平上升并非由细胞坏死造成，而是在术后 7 小时内下降，但术后至少 5 天内仍会保持上升状态。
（四）移植器官
器官移植过程中的手术操作以及后续可能出现的排斥现象均会导致细胞坏死。因此，cfDNA 水平的变化与细胞坏死情况密切相关。通过检测 cfDNA 片段大小，可辅助判断细胞死亡原因是否为坏死。
（五）细胞凋亡
细胞凋亡是 cfDNA 产生的常见机制之一。然而，由于机体对凋亡细胞的清除作用较为高效，因此凋亡产生的 cfDNA 半衰期较短，这使得 cfDNA 检测能够及时反映机体的动态变化。细胞凋亡是一个非免疫、非炎症的过程，通常伴随着中性粒细胞的募集。如果凋亡细胞未能及时被吞噬清除（可能由于吞噬作用的错误摄入或细胞死亡过量），细胞成分会持续泄漏到环境中，引发炎症反应，暴露自身抗原，扰乱免疫耐受性。这种情况下，凋亡细胞可能会触发免疫反应，产生自身免疫现象。这种自然免疫反应取决于经历凋亡的细胞类型、吞噬细胞的种类以及相关抗原是否被识别。在健康人群（如锻炼者）以及孕妇中，并未观察到明显的炎症和自身免疫反应，这表明细胞凋亡并非癌症或其他疾病 cfDNA 的主要来源。此外，某些特定的癌细胞能够抵抗凋亡，持续增殖，并伴随着 cfDNA 水平的上升。
（六）细胞焦亡
细胞焦亡是一种促炎的、依赖 caspase1 的程序性死亡方式，会导致炎症因子 IL - 1β、IL - 18 的释放。细胞焦亡过程迅速，表现为细胞膜皱缩、细胞核完整、细胞核浓度显著增加、细胞膜上形成孔隙、细胞体积增大以及促炎因子的释放。与细胞凋亡不同，细胞焦亡不会引起线粒体降解和细胞色素 C 的释放，因此不会产生 mtDNA 的释放。通过结合细胞形态、炎症因子水平以及 DNA 片段长度等指标，可以区分凋亡、焦亡、坏死以及因无法及时被吞噬的凋亡细胞造成的 cfDNA 上升。
（七）主动释放的 DNA
活细胞（包括健康细胞、肿瘤细胞和病变细胞）能够主动将 DNA 释放到细胞外环境中，而死细胞则不具备这一能力。这些被释放的 DNA 可能并非以包裹的形式存在，而是与某种复合体共同释放。
（八）核酸的胞外囊泡运输
胞外囊泡分为外泌体（30 - 100nm）、凋亡小体（< 4000nm）、蛋白聚合物（40 - 490nm）、大脂质体（500 - 1000nm）以及微泡（MV）（100 - 1000nm）。外泌体在细胞间交流中发挥重要作用，不同来源的外泌体中可能含有转座元件、单链 DNA、基因组 DNA、mtDNA 等成分。血清中的 cfDNA 部分来源于外泌体，且有研究表明 93% 的血浆 DNA 积聚于外泌体中。这表明 ctDNA（循环肿瘤 DNA）可能是由活细胞主动释放的，而非单纯因细胞死亡产生。脂质体能够转运原癌基因和癌症相关信息，原癌小体是由具有阿米巴虫表型的癌细胞分泌而来。癌细胞分泌的外泌体可使体液中肿瘤 DNA 水平上升，促进癌症进程。胞外囊泡（EVs）的分泌是一个耗能且受调控的过程，其包含物受环境因素以及来源细胞的影响。
（九）红细胞细胞核摘除
红细胞在成熟过程中会去除细胞核，在这一过程中会释放 cfDNA。
（十）NETosis
NETosis 是一种仅限于特定造血细胞的现象，是一种快速的、类似爆炸式的过程。该过程涉及细胞核的分裂、细胞死亡，导致中性粒细胞胞外陷阱（NET）的形成，积累与抵抗性相关的物质以及入侵的微生物。巨噬作用对于预防炎症、自身免疫反应以及不可避免的组织损伤具有重要作用。在巨噬作用过程中，核酸会降解，但并非完全降解，最终部分核酸流入体液中。被巨噬作用吞噬的 NET 会因脂多糖刺激而释放促炎因子 IL - 1β、IL - 6 以及肿瘤坏死因子（TNF - α），表明巨噬作用为应对感染或受伤做好了准备。因此，巨噬作用可被视为 cfDNA 的来源之一，也可参与或诱导 cfDNA 的释放，例如在炎症过程中。
三、cfDNA 释放的原因
（一）吞噬 - 介导的 DNA 释放
细胞凋亡过程中，需要吞噬细胞清除凋亡细胞，当吞噬细胞死亡后，会将 DNA 释放出来。
（二）自噬
自噬是细胞内降解清除的过程，通常针对细胞器进行清除。如果自噬作用清除细胞核，将导致细胞死亡。线粒体的清除会释放 mtDNA 到血浆中。自噬作用与 NETosis 类似，在癌症早期可抑制癌症发展，后期则可能促进癌症。早期自噬作用会导致癌细胞死亡，抑制自噬会增加癌症风险。因此，正常情况下自噬并不会直接导致 cfDNA 释放，但在特殊环境下也可能产生 cfDNA。
（三）老化
90 岁以上老年人与年轻人相比，总 cfDNA、非甲基化 cfDNA、RNase P - coding cfDNA 以及 Alu 重复序列的含量和水平存在差异。较高的 cfDNA 总量和非甲基化 cfDNA 总量通常代表身体机能较弱，还与认知损伤、下降的日常身体功能和灵活性相关。而 mtDNA 的拷贝数仅能反映身体机能上的衰弱程度。
（四）DNase 作用
在各种疾病以及癌症中，较低的 cfDNA 水平往往伴随着较高的 DNase 活性。然而，不同来源的 DNase 会带来不同的清除以及释放效果。NET - 抗性的病原体在患者感染中，会产生外源的和内源的 cfDNA。胞外核酸酶会导致 NETs 的 DNA 框架降解，最终使 DNA 释放到体液循环中。
（五）脓毒症
cfDNA 水平超过 800ng/ml 的脓毒症患者通常为重症患者。这部分患者的 cfDNA 一部分来源于宿主自身，另一部分来源于病菌的 DNA，但来自病菌的部分仅占少数。NET 的形成会增加 cfDNA 水平，尤其是在 NET - 抗性的细菌侵入后。活性氧（ROS）也可以不依赖 caspase 激活中性粒细胞，导致 NETs 的释放。然而，也有报道显示 cfDNA 的升高并不一定是中性粒细胞的 NETs 导致的，而可能与其他种类的细胞有关，因为体液中的 H3 组蛋白并未增加。推测可能是因为坏死组织或细胞凋亡所致。
（六）氧化压力
氧化压力参与多种疾病的发生和发展，如心脏病、癌症、神经退行性疾病、肥胖、关节炎、老化以及脓毒症等。它可以引发或参与 NETosis 和细胞凋亡过程，最终导致 cfDNA 的释放。
（七）无菌发炎
即使在没有细菌感染的情况下，机体也可能出现发炎反应。这可能是因为：1. 细胞或神经细胞受到刺激后会释放促炎因子；2. 受伤出血时使用止血剂；3. 细胞死亡。无菌发炎是一种机体自我保护机制，其目的是清除细胞残留物、可溶性致伤物质，通过增加血流量、体液释放以及招募巨噬细胞来维持机体稳态。发炎细胞产生的物质还可以促进细胞分裂和血液供应，NETs 也会在发炎过程中形成。
（八）锻炼
高强度的身体锻炼会导致白细胞的炎症反应和氧化应激。然而，有研究报道锻炼时产生的 cfDNA 与白细胞氧化爆发、白细胞或肌肉细胞凋亡无关，这表明不同形式的锻炼可能引发不同形式的 cfDNA 释放。因此，在取血检测 cfDNA 时，需要注意患者的背景信息，以免误判。
（九）癌症
癌症患者的 cfDNA 来源于癌细胞和周围组织的细胞。细胞死亡是抑制癌细胞的一种方式，但癌细胞能够逃避这一过程，从而增加 cfDNA 的含量。此外，细胞死亡也可能促进癌症发展，可能是通过分泌基质金属蛋白酶（MMP）、生长因子和细胞因子等物质。
四、cfDNA 的检测方法及目的
（一）检测方法
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检测 cfDNA 片段大小
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凝胶电泳：虽然可以对 cfDNA 片段大小进行初步分析，但无法精确检测片段大小。
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qPCR：仅能检测事先选定的特定位点，不适用于基因组范围的全面分析。
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电镜：虽然能够精确测量 cfDNA 片段大小，但操作繁琐、耗时费力，效率较低。
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大规模测序平台：可实现对 cfDNA 片段大小的高通量、精确检测，是目前较为先进的检测手段。
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cfDNA 相关的分子检测
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Windowed protection score（片段大小测量工具）：通过测量基因组内特定点跨越 120bp 的 DNA 片段数量与有端点的片段数量之差来评估核小体距离，进而推测 cfDNA 的来源。
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甲基化检测：采用 plasma DNA tissue mapping 技术，检测 cfDNA 的甲基化状态，以追溯其组织来源。
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（二）检测目的
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判断细胞死亡机制 ：通过检测 cfDNA 的大小，可以推断其是由哪种细胞死亡机制产生的。例如，约 10000bp 的 cfDNA 片段通常由细胞坏死产生；140 - 200bp 的 cfDNA 片段则多由细胞凋亡产生；313 - 798bp 的 cfDNA 片段常见于孕妇体内。
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追溯组织来源 ：检测 cfDNA 相关的分子信号，如甲基化以及核小体距离，有助于追溯其组织来源，为疾病定位提供线索。
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疾病诊断与监测 ：检测特定序列的 cfDNA 的种类和数量变化，可用于判断癌症以及其他相关疾病的存在、发展情况，为临床诊断和治疗监测提供重要依据。
| 名称 | 货号 | 规格 |
| NextPrep-Mag cfDNA Isolation Kit | NOVA-3825-01 | 1-3mL(16-50Isolations) |
| NextPrep-Mag cfDNA Isolation Kit | NOVA-3825-03 | 3-5mL|50ISOLATIONS |
| QIAseq Targeted cfDNA Ultra UDI (12) | 334151 | 12Test |
| QIAseq cfDNA Library Kit (96) | 180015 | 96Test |
