胶回收
一、DNA 凝胶回收的原理
DNA 凝胶回收是从电泳后的凝胶中分离并回收目标 DNA 片段的过程，是生物实验中常用的核酸纯化技术。目前，大多数实验室采用试剂盒法进行 DNA 凝胶回收。试剂盒通常基于硅基质吸附材料，通过特异性吸附 DNA，有效去除体系中的蛋白质、盐类和有机杂质。在洗脱条件下，DNA 从吸附材料上释放，从而实现纯化和回收。
二、凝胶浓度的选择
分离不同大小的 DNA 片段时，需选择合适的凝胶浓度。具体选择如下表所示：
| 凝胶浓度（%） | 线性 DNA 片段长度（bp） |
|---|---|
| 0.5 | 1000～30000 |
| 0.7 | 800～12000 |
| 1.0 | 500～10000 |
| 1.2 | 400～7000 |
| 1.5 | 200～3000 |
| 2.0 | 50～2000 |
三、DNA 凝胶回收的注意事项
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切胶操作 ：切胶时需将目的片段所在位置的胶全部回收。为减少胶体积，可使用较薄的凝胶或薄而宽的梳子进行电泳。切胶时需使用干净的塑料薄膜和无 DNA 污染的刀片，防止外源 DNA 污染。
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DNA 浓度 ：确保 DNA 浓度足够，否则即使切取较小的胶块，也可能因 DNA 含量不足而影响回收效果。
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紫外灯防护 ：在紫外灯下切胶时，需佩戴防护面具或树脂眼镜，避免紫外线对眼睛的伤害。
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试剂盒效率 ：若回收效率较低，可能原因包括胶块未完全溶解（可延长水浴时间并增加颠倒次数）、胶块体积过大（建议切为小块分次回收）、电泳缓冲液 pH 值过高（需调整 pH）或漂洗液中未加入无水乙醇。
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洗脱液选择 ：可使用去离子水洗脱，但实验室纯水 pH 值可能偏低，可通过加入 NaOH 调整 pH 值以提高洗脱效率。
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乙醇残留 ：洗脱产物中残留的乙醇可能影响后续酶切实验，需确保彻底去除漂洗缓冲液。
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洗脱体积 ：不可使用小于说明书规定的最小洗脱体积，否则可能导致 DNA 无法完全洗脱。
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电泳检测 ：若电泳检测仅有一条目的带，可直接使用凝胶回收试剂盒；若对片段纯度要求较高，即使只有一条带，也建议切胶纯化。
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凝胶溶解问题 ：若琼脂糖凝胶胶块不溶，可能原因是琼脂糖质量差、胶块放置过久失水或电泳缓冲液浓度过高。
四、切胶操作的防护措施
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电泳缓冲液和凝胶应为新制备，切胶台需清理干净，刀片最好洗净并灭菌，以确保切下的条带无外源 DNA 污染。
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切胶时需将目的片段所在位置的胶全部回收，可使用薄胶或薄而宽的梳子以减少胶体积。
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在有机玻璃后进行操作即可，佩戴防护面具保护眼睛，若对胶有特殊要求（如不含 EB），可采用 marker 和带刻度尺子拍照定位目的条带。
五、提高胶回收量的方法
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增加电泳时的上样量。
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使用新鲜配制的电泳缓冲液。
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切胶时尽量只切有条带的胶，减少切胶体积。
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将多个胶块融化后合并到同一管中，使用同一吸附柱。
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溶胶时所加溶液适量增加（一般不超过 750μl），以利于 DNA 与膜结合。
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若电泳缓冲液 pH 值偏高，可在溶胶液中加入适量 NaAC；为提高 DNA 截留效率，可在加热溶解后的液体中添加 30% 异丙醇。
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加洗脱液前，将柱子在室温放置几分钟以挥发乙醇。
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洗脱时尽量减少洗脱液体积（一般 30-50μl），洗脱液需滴在膜中央。
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加入洗脱液后，可在 55℃水浴 5 分钟或 50℃水浴 10 分钟以上，或密封于 4℃过夜后再离心。
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将离心后的洗脱液重新加回吸附柱，再次离心以提高回收率。
六、几种 PCR 产物回收方法
（一）普通胶回收
推荐使用试剂盒回收，操作简便且回收率较高。若需手工回收，可切胶后加入 3 倍体积 TE，水浴熔化后进行酚 / 氯仿抽提和乙醇沉淀。
（二）从低熔点凝胶回收 DNA
在 65℃水浴中使凝胶完全溶解后，进行酚抽提和乙醇沉淀，纯化后的 DNA 可用于目的基因结构分析和探针制备等。
（三）扩增特异性好的 PCR 回收
若 PCR 扩增特异性良好，可在产物中加入蛋白酶 K 处理后，进行酚 / 氯仿抽提和乙醇沉淀回收。
七、不需胶回收的直接连接方法
（一）低温冷冻析出法
使用低熔点琼脂糖胶，切下目的条带后置于 -75℃冰箱中 10-30 分钟，离心后取上清用于连接。
（二）酶切后的直接连接
酶切后可直接加入连接酶和另一片段进行连接，以筛选出连接成功的片段。
八、其他注意事项
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电泳缓冲液和凝胶应为新制，切胶台需清理干净，刀片洗净灭菌。
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切胶时需回收整个目的片段所在位置的胶，可使用薄胶或薄而宽的梳子。
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琼脂糖对回收率有影响，若琼脂糖较多，可增加溶胶液体积以保证盐浓度。
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对于小于 100bp 的片段回收，可加入 30% 异丙醇。
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若使用 PAGE 回收，可用 TE 或水溶解，枪头捣碎后过夜浸泡。
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选用回收效率较高的吸附柱，如进口的 Qiaquick spincolumn。
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参照分子克隆方法，可使用低熔点胶或透析带短暂电泳等方法回收 DNA 片段。
九、附注
（一）影响 DNA 在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素
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DNA 分子大小 ：迁移速率与 logN（N 为碱基对数目）成反比，分子越大，迁移越慢。
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琼脂糖浓度 ：不同浓度的凝胶适合分离不同范围的 DNA 片段。
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DNA 构象 ：超螺旋环状 DNA 迁移速率最快，其次是线状 DNA，最后是单链开环 DNA。
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所加电压 ：低电压时，线状 DNA 片段的迁移速率与电压成正比，凝胶上所加电压不应超过 5V/cm。
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碱基组成与温度 ：一般影响不大，在 4-30℃范围内变化不大。
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嵌入染料的存在 ：降低线性 DNA 迁移率，不建议在电泳液中添加。
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电泳缓冲液 ：缓冲液的组成和离子强度影响 DNA 迁移率，常用 1×TAE、1×TBE 或 1×TPE。
（二）安全操作
溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。
（三）电泳指示剂
常用的电泳指示剂为溴酚蓝和二甲苯晴，分别呈蓝紫色和蓝色，用于指示 DNA 片段的迁移位置。
| 名称 | 货号 | 规格 |
| MinElute Gel Extraction Kit (50) | 28604 | 50Test |
| MinElute Gel Extraction Kit (250) | 28606 | 250Test |
| MinElute Gel Extraction Kit (1000) | 28606X4 | 1000Test |
| QIAquick Gel Extraction Kit (50) | 28704 | 50Test |
