病毒转染
病毒转染是将外源基因导入细胞的一种高效方法，其过程主要包括载体构建、病毒包装与提纯以及靶细胞感染。以下以慢病毒（Lentivirus）为例，详细阐述病毒转染的步骤及原理。
一、慢病毒载体构建原理
慢病毒载体基于HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）开发，具有感染分裂细胞和非分裂细胞的能力，可将外源基因整合至宿主染色体，实现持久表达，对多种细胞类型具有高效感染能力，在基因治疗领域展现出巨大潜力。
慢病毒载体的包装系统分为包装成分和载体成分。包装成分由去除顺式作用序列的HIV-1基因组构建，可反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白；载体成分则包含顺式作用序列及异源启动子控制的多克隆位点和目的基因。共转染包装细胞后，可收获携带目的基因的复制缺陷型慢病毒载体颗粒。
慢病毒表达载体包含包装、转染和稳定整合所需的遗传信息。包装质粒提供重组假病毒载体所需的辅助蛋白。为获得高滴度病毒颗粒，需将表达载体和包装质粒共转染细胞，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外培养基中，离心取得上清液后可用于宿主细胞感染。目的基因进入宿主细胞后，经反转录整合到基因组，实现效应分子的高水平表达。
对于一些较难转染的细胞（如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等），慢病毒载体能显著提高目的基因的转导效率，并增加目的基因整合到宿主细胞基因组的几率，为RNAi、cDNA克隆以及报告基因的研究提供了有力工具。此外，慢病毒载体为稳转细胞株的筛选提供了基础，并为活体动物模型实验提供了高质量的包含目的基因的病毒液。
二、慢病毒载体构建及包装流程
（一）实验流程（1和2为并列步骤）
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慢病毒过表达质粒载体的构建
设计上下游特异性扩增引物，并引入酶切位点。通过PCR（采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%）从模板（cDNA质粒或文库）中扩增目的基因的CDS区（coding sequence），将其连入T载体。随后，将CDS区从T载体上切下，并装入慢病毒过表达质粒载体。 -
慢病毒干扰质粒载体的构建
合成与siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体。 -
慢病毒载体的包装与浓缩纯化
制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装质粒，对三种质粒分别进行高纯度无内毒素抽提。将这些质粒共转染293T细胞，转染后6小时更换为完全培养基。培养24小时和48小时后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，并通过超离心浓缩病毒。
（二）实验材料：慢病毒载体、包装细胞和菌株
该病毒包装系统采用三质粒系统，组成为pspax2、pMD2G和pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。其中，质粒上的ZsGreen1表达框可表达绿色荧光蛋白（GFP）。
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细胞株：293T细胞，作为慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM（含10% FBS）。
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菌株：大肠杆菌DH5α，用于扩增慢病毒载体和辅助包装质粒。
三、慢病毒转染细胞实验方法
（一）慢病毒转染贴壁细胞实验方法
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在慢病毒转染前18-24小时，将贴壁细胞以 细胞/孔的密度接种到24孔板中，使转染时细胞数量达到 细胞/孔左右。
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次日，用含6 μg/ml polybrene的2 ml新鲜培养基替换原有培养基，并加入适量病毒悬液，置于37℃孵育。
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对于对polybrene毒性敏感的细胞，4小时后加入2 ml新鲜培养基以稀释polybrene。
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继续培养24小时后，用新鲜培养基替换含病毒的培养基。
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继续培养细胞。若慢病毒携带荧光蛋白，通常转染后48小时可见明显荧光表达，72小时后荧光更为显著。如需通过FACS检测转染效率，可在转染后72-96小时进行。若慢病毒含有抗性基因且需加药筛选，可在转染3-4天后开始加药。
（二）慢病毒转染悬浮细胞实验方法
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在 细胞/ml的悬浮细胞中加入polybrene至6 μg/ml，并加入适量病毒，充分混匀后置于37℃孵育。或者，对于部分难转染的细胞系，可选择150g室温离心4小时，以提高转染效率。
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对于对polybrene毒性敏感的细胞，4小时后（或离心结束后）加入等体积新鲜培养基以稀释polybrene。
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继续培养3-4天，期间可根据细胞生长情况传代或更换培养基。
由于病毒感染细胞的效率通常较低，在操作过程中需注意以下几点：
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感染时尽量减少培养基的体积，以提高病毒浓度。
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每1 ml培养基中加入5-10 μl的Polybrene（储存液浓度为2 mg/ml），可提高转染效率约3-5倍。需注意，尽管病毒感染效率存在个体差异，但只要达到研究目的即可视为成功。
| 名称 | 货号 | 规格 |
| Sera-Mag SpeedBeads 蛋白 A/G 磁性颗粒 | 17152104010150 | 5ml |
| HOIL-1 蛋白 | bulk-HOIL-1-EA | EA |
| Sera-Mag SpeedBeads 蛋白 A/G 磁性颗粒 | 17152104010350 | 100ml |
| SignalSilence ® Stat3 siRNA I | 6580S | 300ul |
