分子克隆技术简介

分子克隆

第一部分：什么是分子克隆

1. 载体构建
   载体构建是分子生物学研究的重要手段，主要包括对多克隆位点（MCS）的改造，以及对启动子、增强子、筛选标记等功能元件的优化。
2. 运载体（Vector）
   运载体是能够将DNA分子运送到受体细胞中的工具。装载外源DNA片段后，运载体仍能正常复制。常见的运载体包括质粒、噬菌体和病毒核酸。
3. 质粒
   质粒是一种双链闭环DNA分子，能够独立于宿主基因组进行复制，是分子克隆中最常用的运载体。
4. 多克隆位点（Multiple Cloning Site, MCS）
   MCS是一段包含多个限制性酶切位点的DNA序列，用于插入外源DNA片段。每个酶切位点通常是唯一的，确保外源DNA的精确插入。

第二部分：质粒的介绍

1. 复制起始位点（Origin of Replication, ORI）
   ORI是DNA复制的起始位置，确保质粒能够在宿主细胞中自我复制。ORI富含A-T碱基，便于在较低温度下启动复制。
2. 启动子区域
   启动子是RNA聚合酶的结合位点，通常位于靶基因上游，长度约为100~1000个碱基对。启动子负责启动基因的转录过程。
3. 终止子
   终止子是转录单元的末端信号，负责释放新合成的RNA。终止子通常位于靶基因的下游，常见于3'端调控元件后。
   • 聚腺苷酸化：在真核生物中，转录后会在mRNA尾部添加多个腺嘌呤核苷酸，延长转录子的寿命。
   • 原核终止机制：分为Rho依赖型和Rho非依赖型终止机制。
   • 真核终止机制：涉及RNA聚合酶I、II和III，分别负责不同类型RNA的转录终止。
4. 抗性基因
   抗性基因用于筛选成功转化的细胞。常见的抗性基因包括氨苄青霉素、氯霉素、四环素和卡那霉素。抗性基因解决了质粒转化效率低和质粒对细胞代谢负担的问题。
5. 多克隆位点（Multiple Cloning Site, MCS）
   MCS是质粒中用于插入外源DNA的区域，包含多个唯一的限制性酶切位点，便于外源DNA的插入和操作。

第三部分：一般构建过程

1. 运载体的准备
   • 质粒可分为F质粒（性质粒）、R质粒（抗药性质粒）和E.coli质粒（大肠杆菌肠毒性质粒）。
   • 根据质粒的复制频率，可分为严紧型（低拷贝）和松弛型（高拷贝）。
   • 制备质粒DNA时，需将含质粒的细菌在含有抗生素的液体培养基中培养至对数期，以扩增质粒。
2. 目的基因的准备
   常见的目的基因获取方法包括：
   • 限制性内切酶直接分离法
   • 文库筛选法
   • 体外扩增法（如PCR）
   • 人工合成法
3. 酶切与连接
   使用限制性内切酶切割载体质粒和外源DNA片段，然后通过DNA连接酶将两者连接，形成重组质粒。
4. 转化/转染
   • 转化（Transformation）：将重组DNA导入原核细胞（如大肠杆菌）。
   • 转染（Transfection）：将重组DNA导入真核细胞（如哺乳动物细胞）。
5. 克隆筛选
   • 抗性基因筛选：通过抗生素筛选成功转化的细胞。
   • 蓝白斑筛选：利用lacZ基因和X-gal底物筛选阳性克隆。

蓝白斑的筛选