逆转录聚合酶链式反应
前言
逆转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription PCR，RT-PCR）是一种将RNA转录为cDNA后进行PCR扩增的技术。该技术广泛应用于基因表达分析、基因克隆、病原体检测、RNA干扰验证等领域。RT-PCR的出现极大地提高了RNA检测的灵敏度，使微量RNA样本的分析成为可能。
RT-PCR的操作方法
RT-PCR的操作方法主要分为一步法和两步法
一步法RT-PCR：将逆转录和PCR扩增在同一反应体系中完成，无需在两个步骤之间打开反应管。这种方法减少了操作步骤，降低了污染风险，特别适合高通量样本分析。然而，一步法对模板RNA的质量要求较高，且由于反应条件的限制，可能无法达到两步法的灵活性。
两步法RT-PCR：先进行逆转录反应生成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。这种方法的优点在于可以优化每个步骤的反应条件，提高反应效率和特异性。此外，两步法可以使用不同的引物进行逆转录和扩增，增加了实验的灵活性。
两种方法如何选择及优缺点对比
模板的选择
在RT-PCR实验中，选择合适的模板至关重要。总RNA和mRNA都可以作为模板，但总RNA更常用。总RNA的优势在于其提取过程相对简单，且可以避免mRNA富集步骤带来的偏差。然而，mRNA在某些情况下能提供更高的灵敏度，尤其是在分析低丰度基因时。
反转录酶的选择
反转录酶是RT-PCR中的关键酶，其选择对实验结果有显著影响。常用的反转录酶包括M-MLV和AMV。M-MLV具有较低的RNase H活性，适合合成较长的cDNA片段；而AMV在较高温度下具有较高的活性，适合处理具有复杂二级结构的RNA。此外，一些经过基因工程改造的反转录酶，如Quant Reverse Transcriptase，具有更高的热稳定性和RNA亲和力，适合多种复杂的RNA模板。
引物的选择
RT-PCR中使用的引物类型包括特异性引物、随机引物和oligo(dT)引物。特异性引物与模板序列互补，适用于已知目的序列的情况。随机引物适用于长的或具有发卡结构的RNA，能与多种RNA模板结合。oligo(dT)引物则适用于具有PolyA尾巴的RNA，但对RNA的质量要求较高。在设计引物时，应确保引物的Tm值相近，避免形成内部发卡结构。
RT-PCR引物设计原则
保守性：选择一段保守的基因片段（100-200 bp）进行扩增，引物设计应跨越内含子，减少基因组DNA污染的风险。
引物长度和Tm值：引物长度通常为18-25 bp，Tm值在50-65℃之间，GC含量在40-60%。避免引物3'端出现4个或更多的G碱基。
RT-PCR实验阴性对照
阴性对照在RT-PCR实验中至关重要，用于检测可能的污染。常见的阴性对照包括无模板对照（NTC）和无逆转录酶对照（No RT）。NTC用于监测反应体系中的污染，而No RT用于检测RNA模板中是否含有基因组DNA。通过设置这些对照，可以有效避免假阳性结果，确保实验的可靠性。
实验操作注意事项
RNA提取应迅速且样本要新鲜，以避免RNA降解。
提取后的RNA应立即进行逆转录，避免长时间存放。
逆转录反应应在无RNA酶的环境中进行，以防止模板RNA降解。
在两步法RT-PCR中，PCR反应中的cDNA模板量不应超过反应体积的1/5。
结论
RT-PCR作为一种强大的分子生物学技术，广泛应用于基因表达分析、病原体检测和基因克隆等领域。通过合理选择操作方法、模板、酶和引物，并严格设置实验对照，可以有效提高实验的成功率和可靠性。随着技术的不断进步，RT-PCR在生命科学研究中的应用前景将更加广阔。
| 名称 | 货号 | 规格 |
| StartScript® One Step RT-PCR Kit | UA070115-50Rxns | 50Rxns |
| QIAGEN OneStep RT-PCR Kit (100) | 210212 | 100Test |
| QuantiTect Probe RT-PCR Kit (200) | 204443 | 200Test |
| QuantiNova Probe RT-PCR Kit (100) | 208352 | 100Test |
