A proteome-wide quantitative platform for nanoscale spatially resolved extraction of membrane proteins into native nanodiscs
膜蛋白（Membrane Proteins，MPs）作为细胞功能的核心要素，在细胞信号转导、物质跨膜运输、能量转换等诸多关键生物学过程中发挥着不可或缺的作用。然而，膜蛋白研究领域长期存在一大棘手难题：如何在不破坏其赖以生存的天然膜环境前提下实现高效提取与深入研究。传统研究手段依赖去膜剂破坏细胞膜来提取膜蛋白，但这一过程极易使膜蛋白丧失天然构象，导致其功能受损或研究结果出现偏差，严重制约了膜蛋白研究的深度与广度，成为生命科学及药物研发领域亟待突破的技术瓶颈。
11 月 28 日发表于 Nature Methods 的重磅研究 “A proteome - wide quantitative platform for nanoscale spatially resolved extraction of membrane proteins into native nanodiscs”，为这一困境带来了创新性解决方案——纳米盘（Nanodiscs）平台。该技术采用独特聚合物库，可在维持膜蛋白天然膜环境稳态的同时，将其从细胞膜中精准、高效地提取出来。纳米盘凭借类似天然膜的微小圆盘状结构，将膜蛋白稳固包裹其中，不仅大幅提升了提取效率与纯度，更为后续研究提供了理想的载体。借助此技术，研究人员得以更精准地剖析膜蛋白的精细结构、探究其生理功能以及解析其与其他生物分子的复杂相互作用，深入挖掘膜蛋白在细胞生命活动中的奥秘，有望推动膜蛋白研究迈向新高度。
这项创新技术的诞生，其价值远超基础科学研究范畴。鉴于膜蛋白在众多疾病发生发展过程中扮演的关键角色，该技术的出现为药物研发和疾病治疗开辟了全新路径。精准研究处于天然膜环境中的膜蛋白，将为设计更具针对性、疗效更佳的药物提供关键依据，助力攻克以膜蛋白为靶点的疾病难题。随着纳米盘平台技术的持续推广与不断完善，膜蛋白研究领域有望迎来革新性发展，为生命科学的深入探索注入强大动力，引领我们逐步揭开生命活动的深层机制，为人类健康事业带来福祉。
传统膜蛋白提取依赖去膜剂破坏细胞膜，虽可提取膜蛋白，却剥离了其天然膜环境，极大限制了研究深度与精准度。为破解这一难题，研究团队匠心独运，开发出基于聚合物的纳米盘平台，成功实现在保留膜蛋白天然膜环境的同时，高效、精准地从细胞膜中提取膜蛋白。该平台的关键创新点在于引入膜活性聚合物库。这些聚合物能与膜蛋白及脂质双层紧密相互作用，将膜蛋白精准包裹于纳米盘内，形成高度稳定的复合物，有效规避了传统去膜剂对天然膜环境的破坏，使膜蛋白的天然结构与功能得以完整保存。
纳米盘是一种由磷脂双层构成的微型圆盘结构，能够高度模拟细胞膜的天然环境。其形成机制主要借助特殊的聚合物，尤其是苯乙烯 - 马来酸共聚物（SMA）等与膜结合的高分子材料，通过与膜蛋白和脂质双层的作用，将膜蛋白包裹其中，形成稳定的膜蛋白复合物，实现不破坏膜蛋白天然结构的提取。具体流程如下：
聚合物选择与膜蛋白包裹：研究人员精心挑选适配膜蛋白的聚合物，多为能与膜蛋白及脂质双层相互作用的膜活性聚合物，常见的如苯乙烯 - 马来酸共聚物（SMA）。这些聚合物与膜蛋白和脂质双层相互作用，将膜蛋白从细胞膜中温和提取出来。
纳米盘的形成：聚合物与膜脂质、膜蛋白结合后，构建出一个类膜结构的小圆盘，即纳米盘。这种结构完美复刻膜蛋白的天然膜环境，彻底隔绝去膜剂干扰。
膜蛋白提取与纯化：纳米盘的包裹使膜蛋白稳定提取，且功能状态得以维持，便于后续开展结构解析、功能检测等深入分析。得益于纳米盘的高稳定性，提取后的膜蛋白能在溶液中保持活性，其环境与天然膜环境高度契合。
开放数据库与优化提取条件：为提升提取效率，研究团队构建开放数据库，收录 2,065 种膜蛋白的提取条件与效率数据。研究人员借此可迅速选定最优提取条件，实现膜蛋白的快速、高效提取。
图 a 展示了商业化及自制合成膜活性聚合物（MAPs）的典型化学结构。这些 MAP 的结构可通过调整疏水与亲水基团比例、功能化 R 基团以及改变聚合物分散性来调控，进而形成多种类型的 MAP。这种多样性为研究人员提供了丰富的 MAP 变体选择，有助于优化膜蛋白提取效率和特异性。
图 b 呈现了基于 RAFT（可控自由基聚合）聚合反应的 MAP 合成方案。该方案采用 PADTC（聚氨基二硫代氨基甲酸酯）、DMF（N,N - 二甲基甲酰胺）和 ACHN（1,1' - 偶氮（氰基环己烷））等试剂，经聚合反应合成 MAP，并进一步优化其结构与功能，以增强膜蛋白提取能力。
图 c 为荧光溶解实验原理图。实验中，先利用融合脂质体将荧光标记脂质导入活细胞以标记细胞膜，再用 MAPs 溶解细胞膜，并收集溶解后的膜及荧光信号。通过荧光测量、动态光散射（DLS）和负染色电子显微镜（negative - stain EM）等技术对溶解效果和膜均一性进行质量控制，确保 MAPs 能有效溶解细胞膜且纳米盘形成稳定。
图 d 展示了溶解定量分析示意图。实验中，先用荧光标记脂质标记膜，记录膜溶解前的荧光强度（fl1），经二硫亚磺酸（dithionite）猝灭后再次测量荧光强度（fl2）。通过对比溶解前后荧光强度，依据公式（1）计算纳米盘提取效率，精准量化膜溶解情况。
图 e 和 f 分别展示了针对 HEK293 细胞和 HeLa 细胞的 MAP 库高通量溶解筛选实验。实验中，先借助融合脂质体将荧光标记脂质送入细胞以标记膜，再用不同 MAPs 溶解细胞膜并计算溶解百分比。若膜所有成分均被溶解，则溶解效率达 100%，与膜初始荧光强度相当。实验表明，不同聚合物的溶解效率各异，研究人员借此可筛选出最有效的 MAPs 用于膜蛋白提取。
膜蛋白的提取效率与纯度
研究团队首先对该平台的有效性和可重复性进行了验证。实验结果显示，这种基于纳米盘的提取方法能够从不同细胞器膜中高效提取膜蛋白，且提取的膜蛋白具有较高的纯度。研究人员进一步证明，该平台能够高效地提取并纯化多种膜蛋白，包括来自突触小泡的膜蛋白。实验数据表明，通过这种方法提取的膜蛋白能够在天然环境中保持功能，具有很高的生物学活性。
此外，该平台还能够用于多蛋白复合物的提取。例如，研究人员成功提取了由两种突触小泡膜蛋白组成的多蛋白复合物。借助这一方法，研究人员能够更深入地探究膜蛋白之间的相互作用及其在细胞中的功能，为理解细胞生命活动提供了有力支持。
图 a 展示了膜活性聚合物（MAP）提取工作流的整体流程。首先，利用 MAP 库溶解细胞膜，通过超离心分离获得 MAP 纳米盘（MAPdiscs），其中的膜蛋白经 MTBE 提取沉淀。沉淀的蛋白质经还原、烷基化处理后，使用胰蛋白酶进行过夜消化。随后，对消化后的肽段进行无标签定量蛋白质组学分析，采用液相色谱 - 串联质谱（LC - MS/MS）进行定量分析。
图 b 展示了在不同提取条件下检测到的膜蛋白（MPs）数量，为评估 MAPs 在膜蛋白提取中的有效性提供了概览。结果显示，不同 MAP 的使用使提取的膜蛋白数量有所差异，反映出各 MAP 的提取效果不同。
图 c 呈现了不同提取条件下膜蛋白覆盖的重叠情况。实验使用了三类聚合物：SMA 系列（SMA200 和 SMA300）、AASTY 系列（AASTY645、AASTY650、AASTY1145 和 AASTY1150）以及 ChloroSMA 系列（ChloroSMA40、ChloroSMA60 和 ChloroSMA80）。尽管存在一定重叠，但有 83 个膜蛋白仅在特定 MAP 条件下被检测到，表明不同 MAP 提取条件可捕获不同类型的膜蛋白，凸显了各聚合物在膜蛋白提取中的特异性。
图 d 展示了通过蛋白质组学筛选，在所有细胞膜系统中检测到的膜蛋白。将筛选出的膜蛋白与 Uniprot 数据库中的细胞器信息对比，标注每个蛋白质的细胞器定位。结果表明，MAP 溶解不仅限于细胞膜表面蛋白质，还涵盖所有膜包被细胞器的蛋白质。这说明 MAPs 能有效溶解所有细胞器的膜蛋白，从而获得全面的膜蛋白数据。
图 e 展示了不同生物学重复实验中各类蛋白质的定量变异性。实验比较不同生物学重复之间的数据，以评估 MAP 提取的重现性。结果显示，大多数 MAPs 具有很高的重复性（R² 接近 1），表明提取过程高度可重复。然而，AASTY1150 在溶解实验中表现不佳，在重复实验中的表现也较差，其溶解效果不稳定，重复性差。
开放数据库
为推广该技术，研究团队开发了一个开放访问的数据库，涵盖了 2,065 种膜蛋白的提取数据。该数据库详尽地记录了每种膜蛋白在不同聚合物下的提取效率，并提供了最佳提取条件。研究人员可借此数据库迅速查找适宜的膜蛋白提取方案，提高实验效率，避免重复实验。
突破传统方法的局限性
相较于传统的去膜剂方法，纳米盘提取技术具有显著优势：
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保留膜蛋白的天然环境 ：传统方法使用去膜剂破坏细胞膜，致使膜蛋白功能丧失，而纳米盘技术可在膜蛋白的天然膜环境中稳定其结构和功能，更精准地反映膜蛋白在生理状态下的行为。
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高效提取与纯化 ：纳米盘技术大幅提高了膜蛋白的提取效率，且提取的膜蛋白纯度较高。实验表明，该平台能从多种细胞器膜中提取膜蛋白，并保持其生物活性，为膜蛋白研究提供了更可靠的实验材料。
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高通量应用 ：纳米盘技术不仅适用于单一膜蛋白的提取，还能进行高通量膜蛋白提取。结合开放数据库中的优化提取条件，研究人员可在短时间内处理大量膜蛋白样本，快速获取其结构、功能及相互作用数据。
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扩展到多蛋白复合物 ：除了单一膜蛋白，纳米盘平台还可提取由多个膜蛋白组成的复合物。这一特性使研究人员能够探究膜蛋白复合物的形成和相互作用，对于理解细胞内膜蛋白的功能和调控机制意义重大。
药物开发与应用前景
由于膜蛋白是众多药物的靶点，能够在天然膜环境中准确提取膜蛋白，对药物研发至关重要。随着该平台的推广，研究人员可更精准地模拟膜蛋白的天然环境，为药物设计提供更准确的靶点信息。许多离子通道、G 蛋白偶联受体（GPCRs）等膜蛋白都是当前药物研发的重要靶点。借助这种新平台，药物研发者可更直观地了解这些靶点的结构和功能，从而设计出更具特异性和效果的药物。
尽管该平台在膜蛋白提取和分析方面展现出巨大潜力，但仍面临一些挑战。一方面，尽管该平台能保留膜蛋白的天然环境，但膜蛋白的复杂性和多样性仍给研究带来困难。不同类型膜蛋白对提取条件要求不同，因此需进一步优化聚合物库，以适应更多种类膜蛋白的提取。另一方面，该平台虽高效提取膜蛋白，但在蛋白质结构解析方面，仍需结合电子显微镜（EM）、质谱（Mass Spectrometry）等其他技术，以获取更详细的结构信息。通过与其他结构生物学技术的结合，可更全面地理解膜蛋白的功能和机制。
总体而言，这种基于纳米盘的膜蛋白提取平台在技术上实现突破，为膜蛋白研究开辟了新方向。通过该方法，研究人员可更接近膜蛋白的天然状态，揭示其在细胞中的复杂功能和相互作用。随着平台的推广和完善，膜蛋白研究将迈入全新的时代，为生物学、医学和药物研发带来无限可能。
| 名称 | 货号 | 规格 |
| Anti-Sodium Potassium ATPase antibody [EP1845Y] - BSA and Azide free | ab167390-100ug | 100ug |
| Anti-Sodium Potassium ATPase antibody [EP1845Y] - BSA and Azide free | ab167390-1mg | 1mg |
| ANTI-ECK/EPHA2/MPK-5 | PA523144 | EA |
| QIAseq靶向测序扩增试剂盒（96） | 333795 | 96T |
