遗传修饰因子调控CAG重复不稳定性：CRISPR-Cas9体内筛选揭示亨廷顿病治疗新靶点
——基于“In vivo CRISPR-Cas9 genome editing in mice identifies genetic modifiers of somatic CAG repeat instability in Huntington's disease”的机制解析
一、引言
亨廷顿病（Huntington's Disease, HD）是一种遗传性神经退行性疾病，其典型症状包括运动障碍、认知功能下降以及精神行为异常。该疾病由HTT基因中CAG三核苷酸重复序列的异常扩增引起，CAG重复次数与发病年龄密切相关，重复次数越多，发病年龄越早。因此，深入理解CAG重复扩增的机制，并寻找能够减缓这一过程的遗传修饰因子，对于开发有效的疾病修饰疗法具有重要意义。
本研究“In vivo CRISPR-Cas9 genome editing in mice identifies genetic modifiers of somatic CAG repeat instability in Huntington's disease”发表于《Nature Genetics》期刊，该研究利用体内CRISPR-Cas9基因编辑技术，在亨廷顿病小鼠模型中系统地筛选影响CAG重复扩增的遗传修饰因子，为揭示CAG重复扩增的分子机制提供了新的见解，并为未来的治疗策略提供了潜在靶点。
二、文献综述
（一）亨廷顿病的遗传学基础
亨廷顿病是一种常染色体显性遗传病，由HTT基因中CAG三核苷酸重复序列的异常扩增引起。HTT基因位于人类4号染色体短臂，其编码的亨廷顿蛋白（Huntingtin, Htt）在神经系统中广泛表达。正常情况下，HTT基因中的CAG重复次数在6 - 35次之间，而当CAG重复次数超过35次时，就会导致亨廷顿病的发生。CAG重复次数与发病年龄呈负相关，重复次数越多，发病年龄越早。
（二）CAG重复扩增的机制
CAG重复扩增是亨廷顿病发病的核心机制之一，但其具体机制尚未完全阐明。目前认为，CAG重复扩增可能与DNA复制、修复以及染色质结构等多个生物学过程有关。例如，在DNA复制过程中，由于DNA聚合酶的滑动特性，可能导致CAG重复序列的扩增。此外，DNA修复系统中的某些蛋白，如错配修复蛋白（Mismatch Repair, MMR），可能在CAG重复扩增过程中发挥重要作用。
（三）遗传修饰因子在亨廷顿病中的作用
遗传修饰因子是指那些能够影响疾病表型但本身并不直接引起疾病的基因。在亨廷顿病中，遗传修饰因子可能通过影响CAG重复扩增、神经毒性以及神经元存活等多个方面，来影响疾病的发病年龄和严重程度。例如，某些DNA修复基因（如Msh2、Mlh1等）已经被证实能够影响亨廷顿病小鼠模型中CAG重复扩增的速度和程度。
（四）CRISPR-Cas9技术在亨廷顿病研究中的应用
CRISPR-Cas9是一种强大的基因编辑工具，能够精确地敲除或修改特定基因。近年来，CRISPR-Cas9技术已经被广泛应用于亨廷顿病的研究中。例如，利用CRISPR-Cas9技术可以构建亨廷顿病小鼠模型，研究CAG重复扩增的机制以及遗传修饰因子在亨廷顿病中的作用。此外，CRISPR-Cas9技术还可以用于开发针对亨廷顿病的基因治疗策略。
三、研究方法
（一）动物模型
本研究使用了HttQ111敲入小鼠模型，该模型携带了含有111个CAG重复的人源化HTT基因，能够模拟亨廷顿病患者的CAG重复扩增过程。
（二）CRISPR-Cas9基因编辑平台
本研究构建了一个基于CRISPR-Cas9的体内基因编辑平台，利用腺相关病毒（Adeno-Associated Virus, AAV）递送sgRNA，在组成型表达Cas9的亨廷顿病小鼠模型中进行基因编辑。该平台能够高效地敲除目标基因，并观察其对CAG重复扩增的影响。
（三）候选基因筛选
本研究首先针对已知的CAG重复扩增修饰基因进行编辑，以验证该平台的可靠性。随后，筛选了大量与CAG重复扩增相关的候选基因，包括DNA修复基因、染色质修饰基因等。
（四）组织特异性研究
由于CAG重复在脑中的扩增对亨廷顿病的发病至关重要，本研究还研究了新鉴定的修饰基因在纹状体中的作用。
（五）双基因敲除实验
为了确认修饰基因之间是否存在相互作用，本研究进行了双基因敲除实验，观察不同基因组合敲除对CAG重复扩增的影响。
四、研究结果
（一）已知修饰基因的验证
本研究首先针对已知的CAG重复扩增修饰基因（如Msh2、Msh3、Mlh1、Mlh3和Fan1）进行编辑，成功验证了该平台的可靠性。敲除Msh2、Msh3、Mlh1和Mlh3显著抑制了CAG重复扩增，而敲除Fan1则增强了扩增。
（二）新修饰基因的鉴定
通过筛选大量与CAG重复扩增相关的候选基因，本研究发现了多个新的修饰基因。敲除Pms1、Pold1和Pold3显著抑制了CAG重复扩增，而敲除Pms2、Msh6和Hmgb1则增强了扩增。
（三）组织特异性研究
本研究发现，纹状体中的CAG重复扩增与肝脏中的结果基本一致，但某些基因（如靶向Pms2）在纹状体中的扩增增强效应更为显著，表明这些基因的作用具有组织特异性。
（四）修饰基因之间的相互作用
本研究通过双基因敲除实验发现，抑制因子之间存在复杂的相互作用。例如，靶向Fan1 + Pms2导致表型与Fan1单独敲除无法区分，而靶向Fan1 + Msh6或Pms2 + Msh6则降低了各自的Fan1或Pms2敲除的影响。
五、讨论
（一）新修饰基因的生物学意义
本研究鉴定了多个新的CAG重复扩增修饰基因，这些基因可能通过影响DNA复制、修复以及染色质结构等多个生物学过程，来影响CAG重复扩增的速度和程度。例如，Pms1和Pold1是DNA聚合酶δ的亚基，可能在DNA复制过程中影响CAG重复序列的稳定性。Msh6是错配修复蛋白MutS的同源物，可能在DNA修复过程中影响CAG重复序列的扩增。Hmgb1是高迁移率族蛋白B1，可能通过影响染色质结构来调节CAG重复扩增。
（二）组织特异性研究的启示
本研究发现，某些修饰基因在纹状体中的扩增增强效应更为显著，表明这些基因的作用具有组织特异性。这可能与不同组织中基因表达水平、蛋白相互作用网络以及表观遗传修饰等因素的差异有关。未来的研究可以进一步探讨这些组织特异性修饰基因在亨廷顿病发病中的作用机制。
（三）修饰基因之间相互作用的复杂性
本研究通过双基因敲除实验发现，抑制因子之间存在复杂的相互作用。这表明，CAG重复扩增的调控网络是一个复杂的系统，多个基因之间可能通过协同或拮抗作用来共同调节CAG重复扩增的过程。未来的研究可以进一步利用生物信息学工具和网络分析方法，来揭示这个复杂调控网络的具体结构和功能。
（四）临床转化的潜力
本研究为理解CAG重复扩增的分子机制提供了新的见解，并为未来的治疗策略提供了潜在靶点。例如，针对新鉴定的修饰基因开发小分子抑制剂或基因治疗策略，可能有助于减缓CAG重复扩增的速度，从而延缓亨廷顿病的发病年龄和减轻疾病的严重程度。此外，利用CRISPR-Cas9技术进行基因编辑，可能为一种潜在的亨廷顿病治疗策略。
六、结论
本研究利用体内CRISPR-Cas9基因编辑技术，在亨廷顿病小鼠模型中系统地筛选影响CAG重复扩增的遗传修饰因子。通过针对已知修饰基因的验证和新修饰基因的鉴定，本研究发现了多个能够显著影响CAG重复扩增的基因。此外，本研究还揭示了这些修饰基因之间的复杂相互作用以及它们的组织特异性。这些发现为理解CAG重复扩增的分子机制提供了新的见解，并为未来的治疗策略提供了潜在靶点。未来的研究可以进一步探讨这些修饰基因在亨廷顿病发病中的作用机制，并开发针对这些修饰基因的治疗策略，以期最终为亨廷顿病患者带来福音。
| 名称 | 货号 | 规格 |
| Anti-GFP antibody [EPR14104] | ab183734-100ul | 100ul |
| Anti-CGBP antibody [EPR19199] - ChIP Grade | ab198977-1ml | 1ml |
| Anti-hSET1/SET1 antibody | ab70378-100ul | 100ul |
| Anti-GFP antibody [EPR14104] | ab183734-40ul | 40ul |
