全转录组扩增（WTA）
一、单细胞测序的概念及特点
单细胞测序技术是指在单细胞分辨率层面，针对基因组、转录组等组学信息开展高通量测序分析的技术体系。尽管其单次实验样本量可扩展至数千乃至上万个细胞（具体规模依据样本类型与研究需求而定），但单细胞分析的核心价值并非单纯追求样本总量，而是通过解析单个细胞的遗传特征实现细胞异质性的精准解析。
为何需要单细胞分辨率的测序？
多细胞生物虽源于单个受精卵的增殖分化，但发育过程中细胞间会逐渐积累遗传与表观遗传差异，形成功能特化的细胞亚群。即便传统分类中同属某一细胞类型，其内部仍存在显著的分子异质性，这些差异正是决定细胞功能多样性的关键因素。
传统测序技术的局限性
传统测序技术聚焦于组织或细胞群的整体分析，所得数据为细胞群体的平均信号，无法捕捉细胞间的异质性特征。而单细胞测序通过解析每个细胞的基因表达谱，能够直接揭示细胞亚群的分子特征与发育轨迹，为理解细胞功能分化的分子机制提供了革命性工具。
二、单细胞检测策略
当前单细胞检测领域主要发展出两类技术路线：
1. 基于物理分离的靶向检测策略
通过流式细胞术（适用于悬浮细胞样品）或激光显微切割（LCM）技术（针对组织切片样本）实现单细胞物理分离，继而构建测序文库并进行独立测序。
该方法存在固有局限性：检测通量低且成本随细胞数量呈线性增长，尤其面对临床样本中10⁹量级的细胞群体时，仅分析数十个细胞可能导致细胞异质性信息丢失和统计代表性不足，难以满足复杂组织的研究需求。
2. 基于分子标记的高通量检测策略
采用微流控技术将单细胞悬液与携带独特分子标签（barcode）的磁珠共同包裹在纳升级油滴中，通过逆转录反应使每个细胞的cDNA文库携带特异性barcode标记。最终通过混合建库和统一测序，借助生物信息学算法解码barcode实现单细胞数据区分。
该技术突破性地实现了单次实验完成数千细胞并行分析，显著提升了检测效率与经济性。其核心技术优势在于：
- 组合标记策略：通过10⁸量级的barcode组合确保细胞身份可追溯性
- 分子扩增偏倚控制：油滴微环境有效减少扩增竞争效应
- 数据解复用算法：开发专用计算框架实现高效信号解卷积
三、单细胞分离制备标准化流程（以肿瘤组织为例）
1. 单细胞悬液制备规范
（1）组织采集与活性维持
采用颈椎脱臼法快速处死实验动物，解剖过程需在低温环境（4℃）中操作，推荐使用预冷的RPMI-1640培养基（含10% FBS）进行组织冲洗，以最大限度保留细胞活力。
（2）组织解离优化策略
- 机械解离：根据下游分析需求（侧重细胞数量或质量）选择组织块体积，在冰浴条件下进行精细剪碎（建议终体积≤1 mm³）。
- 酶解消化：针对不同组织特性选择胶原酶/胰蛋白酶配比及消化时间（如肿瘤组织常用胶原酶IV 200 U/mL + DNA酶I 50 U/mL，37℃消化15-30 min），需通过台盼蓝染色实时监测细胞活性。
- 红细胞去除：对富血红素组织（如肝脾）采用NH₄Cl裂解液处理，需严格控温（37℃作用3 min后立即冰浴终止），重复裂解不超过2次以避免白细胞损伤。
2. 单细胞筛选技术比较
| 技术类型 | 作用原理 | 分辨率 | 通量 | 成本 | 适用场景 |
|---|---|---|---|---|---|
| 有限稀释法 | 梯度稀释至单细胞水平 | 低（群体水平） | 极低 | 低 | 教学演示，已逐渐被淘汰 |
| 显微微管操作 | 手动显微操控捕获 | 单细胞 | <10 cells/h | 高（人力成本） | 稀有微生物分离，临床样本不适用 |
| 激光捕获显微切割 | 激光脉冲切割靶细胞 | 单细胞 | 中等 | 中 | 临床病理样本，但易产生污染 |
| 微流控技术 | 流体动力学精准操控 | 单细胞 | 高（>1000/h） | 极高 | 高精度研究，受限于设备普及度 |
| 流式细胞分选 | 多参数荧光信号分选 | 单细胞 | 极高（>5000/h） | 中 | 主流方法，需平衡速度与细胞活性 |
技术细节补充：
- 流式细胞术优化：采用低流速（<5000 events/s）和分选模式（Purity模式）可显著降低细胞损伤，建议预实验确定目标细胞群FSC/SSC阈值。
- 微流控技术前沿：集成惯性聚焦或介电泳原理的新型芯片，已实现无标记单细胞分选，但需配套专用测序文库构建体系。
四、遗传物质提取与扩增技术
单细胞测序面临的核心挑战在于起始样本中遗传物质的极端稀缺性：典型哺乳动物细胞仅含约10 pg总RNA（其中mRNA占比仅0.1-0.5 pg），而深度测序要求纳克级DNA输入，这意味着需将原始核酸扩增10⁵-10⁶倍。目前，单细胞扩增技术主要分为全基因组扩增（WGA）和全转录组扩增（WTA）两大体系。
1. 全基因组扩增技术演进
-
简并寡核苷酸引物PCR（DOP-PCR）
通过随机引物介导的全基因组扩增，早期实现了单细胞DNA的指数扩增。但该方法存在显著缺陷：扩增覆盖度不均（基因组某些区域过度扩增，其他区域丢失），且易引入PCR偏差，已逐渐被淘汰。 -
多重置换扩增（MDA）
基于Φ29 DNA聚合酶的等温扩增技术，可在常温条件下完成扩增，避免高温导致的DNA损伤。该技术能保留长片段DNA（>10 kb），适用于单核苷酸多态性（SNP）检测和突变分析。但扩增均匀性不足，存在GC含量依赖的扩增偏好。 -
多次退火环状循环扩增（MALBAC）
第三代WGA技术，通过预扩增引物设计和线性扩增策略，显著提升基因组覆盖率和均匀性（>90%覆盖率，偏差系数<0.2）。特别适用于稀有样本（如循环肿瘤细胞）和高度异质样本（如发育早期胚胎细胞）的研究。
2. 全转录组扩增技术体系
单细胞转录组扩增需先提取mRNA并反转录为cDNA，再通过扩增获得检测信号。主流方法包括：
- PCR指数扩增：快速高效但易引入偏差
- 体外转录线性扩增：保真度高但步骤复杂
- Phi29聚合酶扩增：等温扩增且覆盖度优，但成本较高
技术选择原则：
- 研究基因结构变异→优先选择MALBAC
- 检测点突变或拷贝数变异→推荐MDA
- 转录组定量分析→需结合扩增偏差校正算法
| 名称 | 货号 | 规格 |
| Rhapsody反转录试剂盒 | 633773-1 | 1 Test |
| REPLI-g WTA Single Cell Kit (24) | 150063 | 24Test |
| REPLI-g Cell WGA & WTA Kit (12) | 150052 | 12Test |
| BD Rhapsody WTA Amplification Kit | 633801-BDRhapsody | 1Each |
