核酸质控
引言
核酸作为生命遗传信息的载体，其质量直接影响基因测序、PCR检测、基因编辑等分子生物学实验的准确性与可重复性。随着精准医疗时代的到来，核酸质控已从实验室基础操作升级为贯穿科研与临床全流程的关键技术节点。本文系统阐述核酸质控的理论基础、技术体系、应用场景及发展趋势，构建完整的核酸质量管理框架。
核酸质控的核心技术体系
1. 定量分析技术
1.1 紫外分光光度法
基于朗伯-比尔定律，通过核酸在260nm波长处的特征吸收峰进行定量。现代超微量分光光度计（如Thermo Fisher NanoDrop）可实现0.5mm光程下的精确检测，DNA检测限达2ng/μL。该方法需注意：
- 蛋白质污染校正：A260/A280比值异常时（DNA理想值1.8，RNA 2.0），需通过定磷法或考马斯亮蓝法进行交叉验证
- 降解核酸干扰：游离核苷酸会导致浓度虚高，需结合完整性分析综合判断
1.2 荧光定量法
采用PicoGreen、Qubit等荧光染料特异性结合双链DNA，通过标准曲线实现绝对定量。该技术优势体现在：
- 灵敏度突破：可检测低至10pg/μL的核酸样本
- 抗干扰能力：有效排除游离核苷酸、蛋白质等干扰物质
- 多参数检测：Qubit 4.0系统支持DNA/RNA/microRNA同步定量
1.3 实时荧光定量PCR法
通过标准曲线法或ΔΔCt法实现核酸的精准定量。该技术特别适用于：
- 病原体载量检测：如HIV病毒载量测定（检测限50copies/mL）
- 基因表达分析：结合内参基因（如GAPDH、β-actin）进行相对定量
- 甲基化检测：通过亚硫酸氢盐处理后的特异性扩增实现甲基化位点定量
2. 纯度评估技术
2.1 光谱纯度分析
- A260/A280比值：反映蛋白质污染程度，比值<1.7提示蛋白质污染
- A260/A230比值：评估有机溶剂残留，比值<1.8表明存在胍盐、β-巯基乙醇污染
- 光散射校正：采用双波长法（260/320nm）消除悬浮颗粒影响
2.2 电泳纯度分析
- 琼脂糖凝胶电泳：可检测0.1-25kb DNA片段，通过条带清晰度判断RNA污染
- 毛细管电泳：Agilent 2100生物分析仪可实现RNA完整性数值化（RIN值）
- 芯片电泳：LabChip GX Touch系统提供DNA/RNA的浓度、片段分布及标记效率多参数分析
3. 完整性评价技术
3.1 凝胶电泳法
- 脉冲场凝胶电泳（PFGE）：分离10kb-10Mb超大片段DNA
- 微流控芯片电泳：安捷伦Fragment Analyzer实现DNA降解指数（DIN值）自动化计算
- 定量PCR法：通过长片段（>1kb）与短片段（<200bp）扩增效率比值评估降解程度
3.2 测序深度分析
- 全基因组测序（WGS）：通过覆盖度均匀性判断DNA完整性
- 甲基化测序：降解样本会导致CpG位点覆盖度显著下降
- 单细胞测序：低质量DNA（DIN<3）需增加测序深度至500M reads/cell
核酸质控的应用场景
1. 临床诊断领域
1.1 传染病检测
- 新冠核酸检测：需同时检测ORF1ab、N基因及内参基因（RNase P）
- HIV耐药检测：质控标准包括Ct值变异系数（CV<3%）及阴阳性质控合格率（>95%）
- 肿瘤液体活检：ctDNA检测需满足突变等位基因频率（MAF）检测限达0.1%
1.2 遗传病诊断
- 胚胎植入前遗传学检测（PGT）：需达到DNA投料量>5ng且DIN值>7
- 无创产前检测（NIPT）：母体血浆游离DNA需满足GC含量38%-42%
- 罕见病诊断：全外显子组测序（WES）需确保文库插入片段长度150-250bp
2. 基础研究领域
2.1 基因编辑验证
- CRISPR/Cas9实验：需通过T7E1酶切法及Sanger测序双重质控
- 碱基编辑器（BE）评估：需检测indel形成率（<1%）及旁切活性
- 基因敲除小鼠：Southern blot需显示5'、3'及内部探针完整条带
2.2 表观遗传学研究
- ChIP-seq实验：需满足IP效率>10%且阴性对照IgG信号低于输入样本1%
- ATAC-seq：需确保文库插入片段呈现双峰分布（核小体周期性）
- 甲基化测序：需通过亚硫酸氢盐转化率（>99%）及重复序列覆盖度质控
3. 生物制药领域
3.1 质粒DNA生产
- GMP级质粒：需满足超螺旋比例>90%且内毒素<1EU/mg
- 病毒载体包装：慢病毒滴度需达到1×10^8 TU/mL且复制型病毒（RCL）检测阴性
- mRNA疫苗：需通过CE-SDS分析确保加帽效率>95%
3.2 细胞治疗产品
- CAR-T细胞质控：需检测载体拷贝数（VCN）1-5 copies/cell及转基因表达均一性（CV<20%）
- 干细胞治疗：需通过STR鉴定确认细胞株身份且支原体检测阴性
核酸质控的挑战与展望
1. 技术挑战
- 微量样本检测：单细胞测序需突破fg级核酸的精准质控
- 复杂样本处理：FFPE组织需解决DNA交联及片段化问题
- 新技术应用：cfDNA甲基化检测需建立标准化质控流程
2. 发展趋势
- 自动化质控系统：集成样本处理、检测、数据分析的全流程自动化
- 人工智能应用：通过深度学习建立核酸质量预测模型
- 新型质控材料：CRISPR-Cas12a系统开发实时荧光质控探针
结论
核酸质控已形成涵盖定量、纯度、完整性分析的多维度技术体系，在临床诊疗、基础研究、生物制药等领域发挥关键作用。随着测序技术的飞速发展，建立标准化、智能化的质控体系将成为保障生物医学研究质量的核心要素。未来，多组学联合质控与实时监控技术的突破，将推动精准医疗迈向新的高度。
| 名称 | 货号 | 规格 |
| 核糖核酸（酵母） | abs47043139-25g | 25g |
| 核酸酶与核酸清除剂 | abs60331-250ml | 250ml |
| PfAgo核酸内切酶（RADAR用微球) | abs60370-50T | 50T |
| PfAgo核酸内切酶 | abs60340-200uL | 200uL |
