Intra-tumoral sphingobacterium multivorum promotes triple-negative breast cancer progression by suppressing tumor immunosurveillance
研究背景与核心发现
乳腺癌已成为全球女性发病率最高的恶性肿瘤，其发病年龄呈现年轻化趋势，临床治疗仍面临严峻挑战。肿瘤微环境（TME）中的微生物群落作为新兴的调控因子，通过重塑免疫应答及代谢网络深刻影响肿瘤发生发展。尽管微生物组失调与乳腺癌进展的关联性已获证实，但特定病原菌的致病机制及转化应用价值尚未明确。
本研究通过16S rDNA高通量测序技术，首次在乳腺癌组织中鉴定出鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium multivorum，S. multivorum）的显著富集现象。该革兰氏阴性需氧菌属于条件致病菌，此前多与院内感染相关，而其在肿瘤生物学中的功能尚未被报道。进一步机制探索揭示，肿瘤内S. multivorum通过抑制免疫监视加速三阴性乳腺癌（TNBC）进展，其作用模式独立于传统风险因素。研究不仅填补了乳腺癌相关菌群研究的空白，更提出靶向肿瘤内微生物组作为潜在治疗策略的创新思路，为突破TNBC临床治疗瓶颈提供了新靶点。
研究结果
1.乳腺癌患者癌组织和癌旁组织的16S rDNA基因测序分析
为系统解析肿瘤常驻细菌与乳腺癌进展的关联性，研究团队采用16S rDNA高通量测序技术对乳腺癌患者配对癌组织（n=45）及癌旁组织（n=45）进行微生物组学分析（图1）。通过α多样性指数分析揭示，癌组织与癌旁组织间存在显著差异：Chao1指数（P=0.003）和ACE指数（P=0.004）显示肿瘤内细菌群落物种丰富度显著降低，而Shannon指数（P=0.12）和Simpson指数（P=0.09）提示两组间微生物多样性无显著差异（图1A）。加权主坐标分析（PCoA）进一步揭示β多样性差异，轴1解释度达32.7%，明确区分肿瘤与正常组织的微生物群落结构（图1B）。
在属水平微生物组成分析中，Sphingobacterium属以相对丰度3.2%位列第11位（图1C），其核心菌种S. multivorum在癌组织中的富集程度达癌旁组织的8.7倍（P<0.001，图1F-G）。线性判别分析（LDA）效应量（LEfSe）分析证实，S. multivorum（LDA=4.1，P=0.002）与Staphylococcus、Lactococcus共同构成肿瘤特异性微生物标志物，而Sediminibacterium等菌属在癌旁组织中优势生长（图1D-E）。Wilcoxon秩和检验验证显示，S. multivorum的肿瘤内富集具有组织特异性（AUC=0.89，95%CI 0.81-0.94），其检出丰度与肿瘤大小（r=0.62，P=0.001）及淋巴结转移（OR=3.8，95%CI 1.9-7.6）呈显著正相关。
该部分研究通过多维度微生物组学分析，首次在属种水平明确S. multivorum作为乳腺癌组织特异性机会性病原体的核心地位，其富集模式与肿瘤恶性程度的高度关联性为后续功能验证提供了明确靶标。
2.肿瘤内微生物组图谱解析与核心菌群鉴定
鉴于S. multivorum在乳腺癌组织中的显著富集特征，研究通过建立同源4T1乳腺癌小鼠模型，系统评估其肿瘤促进作用（图2A）。体内实验显示，肿瘤内注射S. multivorum（1×10⁸ CFU/只）可显著加速肿瘤生长，治疗组第14天肿瘤体积达对照组的2.3倍（P<0.001，图2B），终末肿瘤重量增加至1.87±0.32g（vs. PBS组0.74±0.19g，P=0.002，图2C）。
通过荧光原位杂交（FISH）技术对肿瘤组织进行细菌定位分析，仅在S. multivorum处理组检测到特异性荧光信号（覆盖度12.4±2.1%），证实其肿瘤内定植能力（图2D）。免疫组化分析揭示，S. multivorum定植导致肿瘤微环境（TME）免疫细胞组成发生显著改变：FoxP3⁺调节性T细胞（Treg）浸润密度增加2.8倍（P=0.003，图2E），而CD8⁺细胞毒性T细胞（CTL）密度降低57.3%（P=0.001，图2F）。流式细胞术分选验证进一步支持该发现，Treg细胞比例从对照组的4.1±0.8%升至9.6±1.3%（P<0.001，图2G），CD8⁺ T细胞比例则从21.4±3.2%降至8.9±1.7%（P=0.004，图2H）。
为明确CD8⁺ T细胞在S. multivorum促癌作用中的功能地位，研究采用抗CD8α中和抗体进行体内耗竭实验。结果显示，CD8⁺ T细胞缺失使S. multivorum处理组的肿瘤生长速率进一步加快（相对生长速率RGR=3.14，P=0.001，图2I-K），肿瘤体积较未耗竭组增加59.2%（P=0.003）。该结果证实，S. multivorum通过重塑TME免疫细胞组成，特别是抑制CD8⁺ T细胞抗肿瘤活性，发挥促癌作用。
本部分研究通过多维度体内外实验，首次证明S. multivorum作为肿瘤内共生菌，通过调节Treg/CD8⁺ T细胞平衡破坏免疫监视，为理解细菌-肿瘤相互作用提供了新范式。
3.S. multivorum定植促进乳腺癌进展的机制验证
为探究S. multivorum对免疫治疗敏感性的影响，研究构建αPD-1单抗治疗模型，通过肿瘤内注射S. multivorum（1×10⁸ CFU/只）或生理盐水，联合腹腔注射抗PD-1单抗（10mg/kg）或同型对照IgG（图3A）。结果显示，S. multivorum显著削弱抗PD-1单抗的疗效：联合治疗组第18天肿瘤体积达1247±189mm³，较αPD-1单抗单药治疗组增加2.1倍（P=0.002，图3B），终末肿瘤重量亦显著升高（2.03±0.41g vs. 0.89±0.24g，P=0.004，图3C-D）。
进一步分析肿瘤免疫微环境改变，免疫组化染色显示联合治疗组FoxP3⁺ Treg细胞浸润密度较单药治疗组增加1.9倍（P=0.007，图3F），而ELISA检测显示肿瘤组织中IFN-γ分泌水平下降47.6%（P=0.005，图3E）。流式细胞术分析证实，CD8⁺ T细胞在肿瘤浸润淋巴细胞中的比例从单药治疗组的19.8±3.7%降至联合治疗组的7.2±1.4%（P=0.003，图3G），且CD8⁺ T细胞表面PD-1表达水平下调（MFI=12.4±2.1 vs. 28.7±4.3，P=0.001）。
机制上，S. multivorum可能通过以下途径诱导免疫治疗耐药：1）上调Treg细胞频率以抑制效应T细胞活性；2）减少IFN-γ分泌削弱肿瘤细胞免疫原性；3）下调CD8⁺ T细胞PD-1表达阻断抗体结合。该发现首次揭示肿瘤内共生菌可通过重塑免疫检查点表达谱影响免疫治疗应答，为克服乳腺癌免疫治疗耐药提供了新思路。
4.S. multivorum通过代谢重编程调控肿瘤免疫微环境的机制研究
为解析S. multivorum促进肿瘤进展的代谢调控网络，研究团队对肿瘤组织进行非靶向代谢组学分析，共鉴定出451种差异代谢物，其中20种代谢物呈现显著表达差异（VIP>1.5，P<0.05，图4A）。代谢物聚类分析显示，7种代谢物（如次黄嘌呤、谷胱甘肽）在S. multivorum组上调，13种代谢物（包括丙酰肉碱、己酰肉碱、丁酰肉碱等短链酰基肉碱）显著下调（图4B-C）。
聚焦三类显著减少的短链酰基肉碱（图4D-F），体外功能实验揭示其免疫调节特性：丙酰肉碱（100μM）处理可显著降低脾脏来源淋巴细胞中FoxP3⁺ Treg细胞比例（从12.4±1.7%降至6.8±1.1%，P=0.003，图4H-I），而同浓度己酰肉碱（P=0.21，图4J）和丁酰肉碱（P=0.18，图4K）无此效应。机制验证表明，丙酰肉碱通过抑制TGF-β/Smad3信号通路阻断Treg细胞分化，其作用不依赖于细胞增殖调控（图4G）。
体内功能挽救实验证实，丙酰肉碱可部分拮抗S. multivorum的促癌作用：联合注射组（S. multivorum +丙酰肉碱，50mg/kg）肿瘤体积较单菌注射组减少42.7%（P=0.009，图4L），终末肿瘤重量降至1.12±0.24g（vs. 单菌组1.87±0.32g，P=0.01，图4M-N）。免疫微环境分析显示，联合治疗组肿瘤内Treg细胞比例恢复至基础水平（8.9±1.4%，P=0.005 vs. 单菌组），且CD8⁺/Treg比值显著改善（3.2±0.6 vs. 1.1±0.3，P=0.002，图4O）。
该部分研究首次揭示肿瘤内共生菌可通过代谢物介导的免疫调节影响肿瘤进展，明确丙酰肉碱作为关键免疫调节代谢物，通过重塑Treg/CD8⁺ T细胞平衡发挥抗肿瘤作用，为开发基于微生物-代谢物轴的免疫治疗策略提供了新靶点。
5.S. multivorum通过IL-17轴驱动免疫抑制微环境的分子机制解析
为阐明S. multivorum促进乳腺癌进展的分子对话机制，研究对S. multivorum刺激的MDA-MB-231细胞进行转录组学分析。RNA-seq数据揭示IL-17信号通路显著富集（NES=3.28，FDR<0.01，图5A-B），差异表达基因分析显示促炎因子（IL-1β）、趋化因子（CCL20、CXCL8）、转录因子（Jun、Fos）及基质金属蛋白酶（MMP9）等28个基因表达上调（log2FC>1.5，图5C）。qPCR验证确认CCL20（4.7倍，P=0.001，图5D）和CXCL8（6.2倍，P=0.002，图5E）的mRNA水平显著升高。
功能验证实验表明，S. multivorum可剂量依赖性诱导肿瘤细胞分泌CCL20（EC50=2.5×10⁶ CFU/mL，图5F）和CXCL8（EC50=1.8×10⁶ CFU/mL，图5G），该效应在两种三阴性乳腺癌细胞系（MDA-MB-231、BT20）中均具可重复性。体内实验证实，肿瘤内注射S. multivorum使肿瘤组织CCL20蛋白水平升高3.1倍（P=0.004，图5H），同时外周血Treg细胞比例从2.4±0.5%升至5.9±1.2%（P=0.006，图5I），形成免疫抑制性TME。
机制溯源发现，丙酰肉碱可通过抑制NF-κB信号通路阻断CCL20/CXCL8表达：在MDA-MB-231细胞中，丙酰肉碱（100μM）处理使CCL20分泌减少68.3%（P=0.003，图5J），CXCL8分泌减少72.5%（P=0.005，图5K），该效应呈浓度依赖性（IC50分别为42.7μM和38.9μM）。研究揭示S. multivorum通过激活IL-17-CCL20/CXCL8轴招募Treg细胞，构建免疫抑制网络，而丙酰肉碱可靶向阻断该病理轴，为代谢-免疫联合干预策略提供理论依据。
6.S. multivorum驱动乳腺癌进展的机制图谱与转化启示
S. multivorum通过多维度调控重塑肿瘤免疫微环境：1）细菌定植激活肿瘤细胞IL-17信号轴，驱动CCL20/CXCL8分泌；2）趋化因子网络招募FoxP3⁺ Treg细胞浸润，同时通过CCL20-CCR6轴排斥CD8⁺ CTL细胞浸润；3）代谢物层面通过下调丙酰肉碱水平削弱Treg细胞抑制功能；4）最终形成以Treg细胞富集、CTL细胞耗竭为特征的免疫抑制微环境，促进肿瘤免疫逃逸与进展。
研究总结
本研究首次揭示肿瘤内共生菌S. multivorum作为乳腺癌进展驱动因子的双重作用机制：
- 免疫调控轴：通过激活肿瘤细胞IL-17-CCL20/CXCL8信号轴，构建Treg细胞招募-CTL细胞排斥的免疫抑制网络。CCL20表达上调直接介导Treg细胞浸润（r=0.72，P<0.001），同时通过竞争性结合CCR6抑制CD8⁺ T细胞归巢（r=-0.64，P=0.002）。
- 代谢调控轴：通过重塑肿瘤内肉碱代谢谱，显著降低丙酰肉碱水平（FC=0.38，P=0.004），解除其对Treg细胞分化的抑制效应，形成代谢-免疫协同促癌机制。
研究创新性提出"微生物-代谢物-免疫"三维调控模型，为乳腺癌治疗提供新靶点：
- 靶向清除S. multivorum或阻断CCL20/CXCL8-CCR6轴可恢复肿瘤免疫监视；
- 丙酰肉碱作为免疫调节代谢物，具有逆转Treg细胞介导免疫抑制的转化潜力；
- 联合代谢干预（丙酰肉碱补充）与免疫检查点抑制剂（抗PD-1/抗CTLA-4）可能产生协同抗肿瘤效应。
未来研究方向应聚焦：1）开发肿瘤内特异性病原菌清除技术；2）建立基于代谢组学的免疫治疗响应预测模型；3）开展丙酰肉碱联合免疫治疗的临床前评估，为突破乳腺癌免疫治疗耐药提供新策略。
| 名称 | 货号 | 规格 |
| Anti-PSGL-1 antibody [PSGL1/1601] | ab218518-100ug | 100ug |
| Anti-Ki67 antibody [SP6] | ab16667-50uL | 50uL |
| Anti-Ki67 antibody [SP6] | ab16667-1ml | 1ml |
| Anti-Ki67 antibody [SP6] | ab16667-500ul | 500ul |
