Longitudinal analysis of the lung proteome reveals persistent repair months after mild to moderate COVID-19

摘要

本研究通过纵向蛋白质组学技术，对45例轻中度COVID-19患者急性期、恢复期及康复期（病程跨度12个月）的支气管肺泡灌洗液（BALF）进行深度分析，系统描绘了肺部蛋白质组的动态演变图谱。研究证实，尽管90%的受试者在康复期（9个月）影像学异常消失，但肺组织仍持续存在修复相关蛋白表达上调及肾素-血管紧张素系统、补体系统、凝血系统的功能失调。这种临床表现与分子病理的分离现象，揭示了SARS-CoV-2感染后肺部持续存在的组织重塑过程，为理解COVID-19后遗症的病理生理机制提供了分子层面的证据。

引言

COVID-19的全球大流行已导致数亿人感染，其中轻中度病例占比超过80%。尽管多数患者可临床治愈，但越来越多的证据表明，相当比例的康复者会出现持续数月甚至更长时间的呼吸系统症状，这种被称为"长期COVID"的综合征严重影响患者生活质量。现有研究多聚焦于急性期炎症反应或重症患者的肺纤维化机制，对轻中度病例康复期肺部微观病理改变的认识仍存在空白。本研究通过纵向蛋白质组学技术，首次系统描绘了轻中度COVID-19患者恢复期肺部蛋白质组的动态演变，为揭示康复期持续组织修复的分子机制提供了新视角。

材料与方法

1. 研究对象与样本采集

• 病例纳入：2020-2021年间招募的45例轻中度COVID-19患者，根据WHO标准分为急性期（确诊后1个月内）、恢复期（3-6个月）、康复期（9-12个月）三组。
• 对照设置：同期招募的29例健康志愿者作为对照，匹配年龄、性别及吸烟史。
• 样本获取：通过纤维支气管镜获取BALF，采用超速离心法分离细胞外囊泡及可溶性蛋白组分。

2. 蛋白质组学分析流程

• 质谱分析：采用数据非依赖性采集（DIA）模式，结合高分辨率qExactive HF-X质谱仪，实现超过5000种蛋白质的定量分析。
• 生物信息学处理：
  • 数据预处理：MaxQuant软件进行肽段鉴定及定量，实施严格的假阳性率控制（FDR<1%）。
  • 差异表达分析：采用线性混合效应模型，校正年龄、性别等混杂因素。
  • 功能富集分析：基于Reactome数据库进行通路分析，构建蛋白质相互作用网络。

3. 临床验证方法

• 影像学评估：采用高分辨率CT（HRCT）定量分析肺实质改变，计算肺纤维化评分（CPFE评分）。
• 肺功能检测：通过单次呼吸法测定一氧化碳弥散量（DLCO），评估肺泡-毛细血管膜完整性。
• 炎症指标监测：ELISA法检测BALF中IL-6、TNF-α、C反应蛋白（CRP）等经典炎症因子水平。

结果

1. 急性期蛋白质组特征

• 炎症反应激活：IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎细胞因子显著上调，伴随补体系统成分（C3、C5）的激活。
• 组织损伤标志物：细胞外基质降解酶（MMP-2、MMP-9）表达增加，肺泡表面活性物质相关蛋白（SP-A、SP-D）水平下降。
• 修复程序启动：胶原蛋白（COL1A1、COL3A1）及纤维连接蛋白（FN1）表达上调，提示肺泡上皮-间质转化（EMT）过程启动。

2. 恢复期动态变化

• 炎症因子消退：IL-6水平较急性期下降57%，但仍显著高于健康对照（p=0.003）。
• 修复相关蛋白持续表达：TGF-β1、VEGF等生长因子表达达到峰值，成纤维细胞活化蛋白（FAP）表达增加3.2倍。
• 免疫细胞浸润：流式细胞术显示BALF中CD4+ T细胞（21.4% vs 8.7%）及CD19+ B细胞（14.2% vs 5.1%）比例持续高于健康对照。

3. 康复期持续异常

• 影像学与功能分离：90%患者HRCT显示纤维化病灶吸收，但DLCO仍较健康对照低18%（p=0.001）。
• 蛋白质组学特征：
  • 细胞增殖标志物（Ki-67）表达持续升高，提示肺泡上皮细胞持续再生。
  • 肾素-血管紧张素系统（RAS）相关蛋白（ACE、ACE2）表达失衡，血管紧张素II水平升高2.1倍。
  • 凝血系统激活：纤维蛋白原（FGB）及组织因子（TF）表达上调，D-二聚体水平与健康对照差异显著（p=0.007）。

讨论

1. 持续修复的分子基础

本研究揭示的康复期蛋白质组特征，提示肺组织处于"修复-重塑"的动态平衡状态。TGF-β1/Smad通路的持续激活，既是组织修复的必要信号，也可能通过诱导肌成纤维细胞分化导致纤维化风险。值得注意的是，这种修复过程并非均匀分布，空间转录组学分析显示，肺泡间隔区成纤维细胞呈现异质性活化模式，部分亚群表达高水平α-SMA，提示存在异常修复倾向。

2. 系统性调控网络失调

康复期观察到的RAS系统紊乱具有双重病理意义：一方面，血管紧张素II通过AT1受体介导促纤维化效应；另一方面，ACE2表达恢复不足可能影响肺泡表面活性物质的代谢平衡。补体系统的持续激活（C3a/C5a水平升高）则通过招募中性粒细胞，形成"炎症-修复"的正反馈环路，这种机制在特发性肺纤维化（IPF）患者中亦被观察到。

3. 临床转化启示

• 生物标志物开发：康复期持续异常的蛋白质（如FAP、Ki-67）可作为评估肺组织修复状态的指标，指导个体化干预时机选择。
• 治疗靶点探索：针对TGF-β1信号通路的单克隆抗体（Fresolimumab）在IPF治疗中已显示疗效，其能否阻断COVID-19后纤维化进程值得进一步研究。
• 康复策略优化：基于蛋白质组学特征，建议对持续DLCO降低的患者实施抗凝治疗（如低分子肝素），以阻断凝血-炎症级联反应。

结论

本研究通过纵向蛋白质组学分析，首次系统描绘了轻中度COVID-19患者康复期肺部的分子病理图谱。研究证实，尽管临床症状和影像学表现改善，但肺组织仍存在持续的修复活动及调控网络失调。这种"分子层面后遗症"不仅解释了长期COVID的部分临床表现，也为开发针对性干预策略提供了科学依据。未来研究需进一步探索不同病毒变异株感染对蛋白质组重塑的影响，以及疫苗接种对康复期病理进程的修饰作用。

 

名称	货号	规格
5-HEXADECANOYLAMINOFLUORE	H110	100MG
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade	V5071	20μg
NP TRANSFER BUF (20X)	NP0006	125ML
10% SDS SOLUTION 500 ML	AM9822	EACH