Wittig reagents for chemoselective sulfenic acid ligation enables global site stoichiometry analysis and redox-controlled mitochondrial targeting
今日学术推荐：
国家蛋白质科学中心杨靖研究员团队与美国斯克里普斯研究所Kate Carroll教授课题组合作，在《自然·化学》（Nature Chemistry）期刊发表题为"Wittig reagents for chemoselective sulfenic acid ligation enables global site stoichiometry analysis and redox-controlled mitochondrial targeting"的开创性研究成果。该研究通过发展新型化学选择性标记策略，为氧化还原蛋白质组学研究提供了革命性技术突破。
杨靖课题组长期致力于氧化还原修饰的定量蛋白质组学研究，成功构建了基于点击化学（Click Chemistry）的高通量探针工具箱，实现了对蛋白质氧化还原修饰位点的精准定位与动态转换的定量解析。此次合作中，研究团队创新性地将Wittig试剂应用于亚磺酸（sulfenic acid）的化学选择性标记，通过共价捕获策略突破了传统方法在氧化还原位点定量分析中的技术瓶颈。该技术不仅实现了蛋白质组水平氧化还原修饰位点的全局性定量分析，更揭示了线粒体靶向的氧化还原调控新机制。
Carroll实验室作为氧化还原生物学领域的国际领军团队，始终聚焦于通过化学合成与蛋白质组学技术的交叉融合，解析以半胱氨酸氧化为核心的细胞信号转导网络。本次合作成果深度整合了合成化学、定量蛋白质组学与细胞生物学研究范式，为理解氧化还原依赖的细胞调控机制提供了全新维度。研究建立的亚磺酸标记策略具有卓越的化学选择性，可实现生理条件下蛋白质氧化还原修饰的动态监测，为氧化还原信号转导、药物靶点发现及疾病干预策略开发奠定了重要方法学基础。该工作标志着氧化还原蛋白质组学技术体系的重大进展，其开发的Wittig试剂介导的共价标记策略，为解析复杂生物体系中的氧化还原修饰网络提供了前所未有的时空分辨率，有望推动氧化还原生物学领域向定量系统生物学层面的跨越式发展。
本文报道了一种基于Wittig试剂的创新型化学选择性标记策略，该技术巧妙利用有机磷叶立德试剂与半胱氨酸氧化修饰关键产物——次磺酸（S-sulfenic acid）的独特反应活性，通过叶立德亲核α-碳与亲电γ-硫的偶联反应形成共价键，实现了对氧化还原敏感型半胱氨酸残基的高选择性标记。该反应体系展现出三大核心优势：其一，卓越的化学选择性可在复杂生物体系中精准区分S-亚磺酰化修饰与其他硫醇氧化态；其二，亚分钟级反应速率满足活细胞动态过程追踪需求；其三，在生理缓冲体系及细胞培养条件下均表现出优异的生物相容性。
研究团队系统验证了该技术的多维应用潜力：在蛋白质组学层面，通过定量质谱分析实现了S-亚磺酰化修饰位点的全局化学计量学解析，突破了传统方法仅能进行定性/半定量分析的技术瓶颈；在细胞生物学维度，开发了氧化还原响应型线粒体靶向递送系统，利用三苯基膦阳离子的氧化还原依赖性生成机制，首次实现了线粒体基质内半胱氨酸氧化还原状态的动态可视化。特别值得注意的是，该策略成功解析了氧化还原信号触发的小分子线粒体靶向递送过程，揭示了线粒体氧化应激与物质转运调控之间的动态关联。
这项工作不仅为氧化还原蛋白质组学研究提供了革命性的技术工具，更开创了化学生物学研究的新范式。其建立的共价标记策略可扩展至其他活性硫物种的检测，为解析蛋白质氧化还原修饰网络提供了时空分辨率达单氨基酸水平的定量分析平台，标志着氧化还原依赖的细胞信号转导机制研究迈入精准定量新时代。
Wittig试剂作为有机合成领域的经典工具，其化学选择性在生物相容性反应体系中的开发仍具探索空间。本研究创新性地将次磺酸（S-sulfenic acid）——蛋白质半胱氨酸氧化还原修饰的关键中间体（图1b）——确立为新型反应靶点。次磺酸的生成存在双重路径：既可通过活性氧物种（如H₂O₂）直接氧化硫醇盐形成，亦可经亚磺酰卤、环状亚磺酰胺及极化亚硝基硫醇/二硫化物水解衍生。值得注意的是，蛋白质硫醇-次磺酸对（pKa 6-7）在生理pH条件下呈现质子化与去质子化动态平衡，赋予其作为氧化还原响应开关的独特属性，可精准调控蛋白质功能、构象及亚细胞定位。然而，过度氧化应激将导致次磺酸进一步氧化为亚磺酸（RSO₂H）或磺酸（RSO₃H），或与生物硫醇发生缩合生成二硫化物。
本研究突破性揭示了Wittig试剂与次磺酸间的化学选择性偶联反应（图1c），通过叶立德亲核α-碳对亲电γ-硫的立体专一性攻击，构建C-S共价键。该反应体系展现出三大核心优势：1）卓越的化学选择性可精准区分次磺酸与其他生物硫物种（如过硫化物、亚磺酰胺）；2）亚分钟级反应速率满足动态生物过程追踪需求；3）在生理缓冲体系及活细胞环境中均表现出优异的生物相容性（图1d-e）。尤为重要的是，该策略成功实现了对蛋白质组水平S-亚磺酰化修饰位点的定量解析，并为氧化还原调控的线粒体靶向递送系统开发提供了新型化学工具。此项工作不仅拓展了Wittig试剂的生物正交反应应用场景，更开创了氧化还原信号转导机制研究的新维度。
作者首先设计并合成了系列功能化Wittig衍生物——含炔烃标签的Wittig-炔烃（WYne）探针（图2a）。在二肽次磺酸模型体系中，WYne探针展现出与母体Wittig试剂3-5相当的强反应活性（图2a-d），其反应速率常数在生理pH范围内跨越160至15,000 M⁻¹s⁻¹数量级，且未观察到与谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）、S-亚硝基谷胱甘肽（GSNO）、半胱氨酸亚磺酸（Cys-SO₂H）及谷胱甘肽磺酸（GSO₃H）等生物硫物种的交叉反应（图2d）。这些数据表明，WYne探针可在中性水相条件下实现次磺酸的高选择性标记，预示着其向复杂生物体系拓展的潜在价值。
为验证蛋白质水平的反应特异性，研究选取谷胱甘肽过氧化物酶3（Gpx3）C36位点作为模式体系（图2e）。完整质谱分析证实，WYne探针可高效修饰Gpx3-SOH（氧化态），但对其还原态（Gpx3-SH）、过氧化态（Gpx3-SO₂H）及二硫键变构体（Gpx3 C64S-SS）均无修饰活性（图2f）。进一步评估了WYneC/WYneN探针穿透活细胞膜并标记内源性靶蛋白的能力（图2h），发现标记效率呈现明确的时间-剂量依赖性特征。上述可行性研究证实，功能化Wittig试剂与次磺酸中亲电硫原子的反应策略，可有效拓展至蛋白质组水平的标记应用。
为系统解析S-亚磺酰化修饰图谱，研究构建了基于WYneN探针的化学蛋白质组学技术平台（图3a）。通过整合小分子模型研究、重组蛋白验证及定量质谱分析，全面证实WYneN探针可在多种生物相容性条件下实现次磺酸的高选择性共价捕获。该技术平台不仅突破了传统方法对次磺酸检测灵敏度的限制，更开创了氧化还原蛋白质组学研究的新维度，为解析细胞氧化还原信号网络提供了革命性技术工具。
为构建氧化还原响应型线粒体靶向递送系统，研究团队创新性地将Wittig试剂与次磺酸化学选择性反应拓展至阳离子三苯基膦（TPP）衍生物的合成（图1e）。该策略突破传统线粒体靶向配体的被动富集模式，通过化学键合实现氧化还原信号触发的精准递送，为活细胞内物质转运调控提供了时空分辨率可控的新型工具。
研究以亚砜为次磺酸前体分子，构建了氧化还原激活型递送系统（图4a）。合成系列硫醚前体（12-14）后，利用生物系统免疫应答产生的次氯酸（HOCl）作为氧化剂，将其转化为亚砜中间体。该去笼化反应速率可通过C-2位吸电子基团调控（pKa=5.2-6.8），实现10分钟至6小时的可控释放窗口。进一步采用Wittig试剂3-5捕获新生次磺酸，高效合成TPP衍生物15-17。其中，酯衍生物16与Wittig试剂4的反应产率达92%，其线粒体共定位系数（R=0.55）显著高于二硫化物对照化合物18（R=0.39）及酮类衍生物15（R=0.80），证实TPP阳离子的pKa调控对线粒体靶向效率的关键作用。
在酶促氧化还原循环模型中，髓过氧化物酶（MPO）催化内源性HOCl生成，成功触发前体13的氧化去笼化及后续Wittig反应，生成线粒体靶向载体16（图4b）。该策略在活细胞体系得到验证：LPS刺激RAW 264.7巨噬细胞产生内源性HOCl，可有效激活递送系统，而MPO抑制剂处理组则未观察到线粒体富集现象（图4c-e）。
为拓展该平台的生物医学应用，研究以辅酶Q10为功能载体，合成含氧化还原响应次磺酸前体的衍生物19（图4f）。经HOCl/Wittig试剂4序列处理后，以83%产率获得TPP-辅酶Q10偶联物WittigQ（20）。荧光标记实验显示，WittigQ在HeLa细胞中呈现典型线粒体定位模式，且该定位可被线粒体解偶联剂FCCP特异性消除（图4f）。功能验证表明，WittigQ可有效维持线粒体膜电位，其抗氧化效能与商业化线粒体靶向药物MitoQ相当，并在脂质过氧化保护实验中表现出显著的剂量依赖性抑制效应（图4g）。本研究开创的氧化还原触发型递送系统，通过化学选择性反应实现治疗分子的时空精准递送，为线粒体靶向药物设计及氧化还原信号转导机制研究提供了全新策略。
综上，本研究基于Wittig试剂开发了WYne系列"可点击"化学探针，通过系列体外生化实验与细胞标记验证，证实其可与次磺酸发生特异性共价反应，反应速率常数高达15,000 M⁻¹s⁻¹，比传统Dimedone探针快1500倍。基于WYneN探针构建的化学蛋白质组学技术平台，首次实现了细胞次磺酸修饰组的位点特异性定量分析，揭示其动态修饰图谱。值得注意的是，定量蛋白质组学数据显示，与磷酸化、乙酰化等经典翻译后修饰类似，多数具有生理调控功能的次磺酸修饰位点修饰占比低于5%，提示亚化学计量水平的氧化还原修饰即可产生显著生物学效应。该发现为理解氧化还原信号转导的"阈值效应"提供了关键实验证据。
| 名称 | 货号 | 规格 |
| (试剂)3-(2,5-DIOXOIMIDAZOLIDIN-4-YL)PROPANOIC ACID | abs42122474-100mg | 100mg |
| (试剂)4-(2-CHLOROISONICOTINOYL)MORPHOLINE | abs42129941-100mg | 100mg |
| Ig Lambda PE 试剂 | 652812 | 50T |
| CD33 PE-CY7 (RUO)试剂 | 333946 | 100T |
