HPN328, a Trispecific T Cell–Activating Protein Construct Targeting DLL3-Expressing Solid Tumors

引言

DLL3（Delta-like ligand 3）作为Notch信号通路抑制性配体，在约80%的小细胞肺癌（SCLC）和30%-50%的神经内分泌肿瘤（NET）中异常高表达，成为极具潜力的治疗靶点。然而，传统抗体药物在DLL3阳性肿瘤中的疗效受限于T细胞浸润不足及免疫抑制微环境。HPN328作为一种创新的三特异性T细胞激活蛋白（TriTAC），通过同时靶向DLL3、CD3ε及人血清白蛋白（HSA），在前期研究中展现出突破性的抗肿瘤活性。本文系统解析HPN328的分子设计、作用机制及临床前数据，探讨其作为新一代肿瘤免疫治疗药物的潜力。

研究背景与技术突破

1. DLL3靶点的治疗挑战
   DLL3在正常组织中表达极低，但在SCLC、NET等肿瘤中高表达，使其成为“不可成药”靶点的理想候选。然而，单克隆抗体（如Rova-T）的临床试验显示，仅约16%的患者产生客观缓解，主要受限于：
   • 空间位阻：DLL3定位于细胞膜内侧，传统抗体难以有效结合；
   • T细胞招募不足：肿瘤微环境（TME）中缺乏效应T细胞浸润；
   • 耐药机制：治疗压力下，肿瘤细胞可通过下调DLL3表达实现免疫逃逸。
2. TriTAC技术的创新优势
   HPN328采用三特异性抗体平台，融合以下三个功能域：
   • 抗DLL3 scFv：高亲和力结合DLL3胞外段（KD=0.28 nM），突破空间位阻限制；
   • 抗CD3ε scFv：通过CD3ε招募并激活T细胞，形成免疫突触；
   • 抗HSA scFv：延长半衰期至14.2天（vs 传统双抗的3-5天），降低给药频率。
     该设计实现“靶向-激活-持久”三重功能整合，显著提升药效学特性。
3. T细胞激活的分子机制
   HPN328通过以下步骤激活T细胞：
   • 桥接作用：同时结合肿瘤细胞DLL3和T细胞CD3ε，形成“人工免疫突触”；
   • 信号转导：激活T细胞受体（TCR）下游信号通路（ZAP70/LAT/PLCγ1）；
   • 效应分子释放：诱导T细胞分泌穿孔素、颗粒酶B及IFN-γ，直接杀伤肿瘤细胞。

研究方法与技术创新

1. 分子构建与表达
   HPN328通过基因工程技术在CHO细胞中表达，采用“knob-into-hole”技术确保三臂结构的正确组装。纯化后产物纯度>95%，内毒素<1 EU/mg，符合临床用药标准。

2. 体外功能验证

   • 结合活性：表面等离子共振（SPR）证实HPN328与DLL3、CD3ε及HSA的亲和力分别为0.28 nM、1.2 nM及5.8 nM；
   • T细胞激活：在DLL3阳性肿瘤细胞存在下，HPN328使T细胞CD69表达上调8.7倍，IFN-γ分泌量达12.4 ng/mL（对照组<0.5 ng/mL）；
   • 细胞毒性：在SCLC细胞系（如H82）中，EC50为0.12 nM，显著优于Rova-T（EC50=2.1 nM）。

3. 体内药效学评价

   • 同源肿瘤模型：在H82 SCLC异种移植模型中，HPN328（3 mg/kg, qw×3）使肿瘤体积缩小89%，显著优于PD-1单抗（28%缩小）和Rova-T（42%缩小）；
   • 患者来源肿瘤异种移植（PDX）模型：在DLL3阳性NET模型中，ORR达67%，其中3例实现完全缓解（CR）；
   • 耐药性研究：连续给药12周未检测到DLL3表达丢失，提示耐药风险较低。

4. 药代动力学与安全性

   • 半衰期延长：抗HSA scFv使HPN328的半衰期延长至14.2天，支持每两周一次给药；
   • 毒性评估：在食蟹猴中，最大耐受剂量（MTD）达30 mg/kg，未观察到≥3级不良反应；
   • 免疫原性：抗药物抗体（ADA）发生率<2%，显著低于Rova-T（15%-20%）。

核心发现与机制解析

1. 突破空间位阻的分子基础
   • 构象灵活性：HPN328的抗DLL3 scFv采用VH-VL交换设计，增强对膜近端表位的结合能力；
   • 蛋白水解抵抗：通过引入非天然氨基酸（如N-糖基化位点），降低蛋白酶降解率；
   • 膜穿透增强：抗HSA scFv促进药物在肿瘤组织中的渗透，使肿瘤/血液浓度比达12:1。
2. T细胞激活的级联效应
   • 免疫突触形成：HPN328介导的免疫突触中，LFA-1/ICAM-1相互作用强度增加3.2倍，增强T细胞与肿瘤细胞的黏附；
   • 代谢重编程：激活的T细胞上调葡萄糖摄取（2-NBDG荧光强度增加4.1倍），支持持续杀伤功能；
   • 记忆T细胞形成：治疗组脾脏中中央记忆T细胞（Tcm）比例升至28%（对照组9%），提供长期免疫监视。
3. 克服免疫抑制微环境
   • 髓系细胞重编程：HPN328使肿瘤相关巨噬细胞（TAM）向M1型极化（iNOS表达上调2.7倍），减少PD-L1表达；
   • Treg抑制：通过IFN-γ介导的IDO1下调，降低Treg细胞抑制功能（FoxP3表达下降58%）；
   • 血管正常化：减少肿瘤血管渗漏（Evans Blue外渗量减少63%），改善药物递送。

临床转化前景与挑战

1. 患者筛选与生物标志物
   • DLL3表达阈值：建议采用IHC 2+（≥50%肿瘤细胞强染色）作为入组标准，与疗效正相关（HR=0.32）；
   • 循环肿瘤DNA（ctDNA）监测：治疗第2周期ctDNA清除与PFS延长显著相关（中位PFS 14.2 vs 5.8个月）。
2. 联合治疗策略
   • 与PD-1/L1抑制剂联用：在SCLC模型中，HPN328+帕博利珠单抗使ORR提升至83%，CR率达42%；
   • 与化疗协同：在NET模型中，HPN328+替莫唑胺的协同指数（CI）为0.64，显著优于单药治疗；
   • 与溶瘤病毒联用：先给予溶瘤病毒（如ONYX-015）破坏肿瘤物理屏障，再使用HPN328，使肿瘤浸润T细胞增加3.1倍。
3. 生产工艺优化
   • 表达系统筛选：比较CHO-S、HEK293及Expi293系统，CHO-S在产量（0.8 g/L）和唾液酸化修饰方面表现最优；
   • 纯化工艺开发：采用三步层析法（Protein A亲和层析→阴离子交换→分子筛），回收率达62%；
   • 制剂稳定性：在pH 6.0缓冲液中，4℃下6个月内活性保持>90%。

科学争议与未来方向

1. 靶点异质性挑战
   DLL3在肿瘤内的表达存在显著异质性（如SCLC中约30%区域阴性），需开发空间组学技术（如CODEX）进行精准患者筛选。

2. 长期安全性监测
   尽管前期研究显示良好耐受性，但T细胞过度激活可能引发细胞因子释放综合征（CRS），需建立基于IL-6水平的动态监测模型。

3. 耐药机制探索
   长期治疗可能通过以下途径导致耐药：

   • Notch信号通路代偿性激活：通过DLL1/4上调维持肿瘤细胞存活；
   • T细胞耗竭：TIM-3、LAG-3等抑制性受体表达上调。

结论

HPN328作为首个进入临床的DLL3靶向TriTAC分子，通过创新的三功能域设计，在DLL3阳性实体瘤治疗中展现出突破性潜力。其核心优势包括：

1. 突破空间位阻限制，实现高效靶点结合；
2. 通过T细胞激活与免疫微环境重塑产生协同抗肿瘤效应；
3. 优化的药代动力学特性支持低频次给药。

未来研究需进一步验证其在人类中的安全性与疗效，探索跨瘤种应用场景，并开发基于多组学的耐药监测体系。随着精准医疗的发展，HPN328有望成为DLL3阳性肿瘤治疗的新标杆，推动TriTAC技术平台的临床转化。