Defining melanoma combination therapies that provide senolytic sensitivity in human melanoma cells
摘要
黑色素瘤作为恶性程度最高的皮肤肿瘤，其治疗耐药性问题长期制约患者预后。本研究通过高通量药物筛选平台，系统评估了128种靶向药物与衰老诱导剂（Navitoclax）的协同效应，在5种人源黑色素瘤细胞系中鉴定出PI3K/mTOR抑制剂（Voxtalisib）与BCL-2抑制剂的联合用药方案。该组合通过激活p53-p21-Rb轴诱导肿瘤细胞衰老，同时破坏线粒体膜电位触发线粒体凋亡通路，形成“双重打击”机制。体内外实验证实，该方案可显著抑制肿瘤生长，延长生存期，且在BRAF野生型及突变型细胞中均具活性。本研究为克服黑色素瘤治疗耐药提供了创新策略，为临床转化奠定理论基础。
引言
黑色素瘤发病率呈逐年上升趋势，约50%患者存在BRAF基因突变。尽管靶向治疗（如BRAF抑制剂）及免疫检查点抑制剂（如PD-1抗体）显著改善了部分患者预后，但耐药性问题仍普遍存在。细胞衰老作为肿瘤抑制机制，其特征为不可逆细胞周期停滞，但肿瘤细胞可通过衰老相关分泌表型（SASP）促进治疗抵抗。如何有效诱导肿瘤细胞衰老并清除衰老细胞（senolysis），成为突破治疗瓶颈的关键。
研究方法
1. 药物筛选平台构建
研究团队建立高通量药物筛选体系，包含：
- 5种人源黑色素瘤细胞系（A375、SK-MEL-28、MeWo、WM266-4、UACC-257），覆盖BRAF突变型及野生型；
- 128种靶向药物库，涵盖信号通路抑制剂、表观遗传调节剂等类别；
- 衰老诱导剂Navitoclax（BCL-2/BCL-xL抑制剂）作为基础用药。
2. 衰老表型鉴定
通过多重检测手段定义衰老细胞：
- β-半乳糖苷酶染色（SA-β-gal）检测衰老相关酶活性；
- 免疫荧光标记p16INK4a及p21CIP1蛋白表达；
- 流式细胞术分析细胞周期分布（G0/G1期阻滞）。
3. 机制研究方法
- 蛋白质组学分析：TMT标记定量蛋白质组学技术；
- 代谢组学检测：GC-MS靶向代谢组学平台；
- 基因编辑工具：CRISPR-Cas9系统构建p53敲除细胞系。
4. 体内验证模型
- 异种移植瘤模型：A375细胞皮下接种裸鼠；
- PDX模型：患者来源肿瘤组织直接移植；
- 动态监测：生物发光成像（BLI）及MRI技术。
核心发现
1. Voxtalisib与Navitoclax的协同效应
在128种药物中，Voxtalisib（PI3K/mTOR双靶点抑制剂）与Navitoclax联用展现最强协同作用：
- 体外：A375细胞中，单药Navitoclax IC50=15.2μM，联用后IC50降至3.8μM（协同指数CI=0.32）；
- 体内：异种移植瘤模型中，联用组肿瘤体积较单药组缩小68%（p=0.001）。
2. 双重机制解析
机制1：衰老诱导
- Voxtalisib通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路，激活p53-p21-Rb轴，导致G1期阻滞；
- Navitoclax抑制BCL-2/BCL-xL，增强p53稳定性，形成正反馈环路；
- 衰老细胞比例从单药组的12%提升至联用组的45%（p<0.001）。
机制2：线粒体凋亡触发
- 联用导致线粒体膜电位崩溃（JC-1染色显示ΔΨm下降57%）；
- 细胞色素C释放增加3.2倍，激活caspase-9/3级联反应；
- 凋亡细胞比例从单药组的8%升至联用组的29%（p=0.003）。
3. 代谢重编程特征
蛋白质组学揭示联用导致：
- 糖酵解关键酶（HK2、PKM2）表达下调40%-60%；
- TCA循环相关蛋白（IDH2、SDHB）表达上调2.1-2.8倍；
- 谷氨酰胺代谢酶（GLS1）表达降低75%。
4. 耐药机制突破
在BRAF野生型细胞系（MeWo）中，联用方案仍具显著活性：
- 肿瘤生长抑制率达62%（p=0.004）；
- 克服单药治疗中常见的MAPK通路再激活耐药机制。
机制深化研究
1. 衰老相关分泌表型（SASP）调控
联用方案显著降低SASP因子分泌：
- IL-6水平下降78%（ELISA检测）；
- IL-8水平降低65%（p=0.002）；
- 抑制肿瘤微环境中免疫抑制细胞的招募。
2. 肿瘤干细胞清除
联用导致肿瘤干细胞标志物（CD133、CD271）阳性细胞比例从18%降至5%（p=0.001），可能通过破坏干细胞自我更新能力实现。
3. 免疫原性细胞死亡（ICD）诱导
联用促进ICD标志物释放：
- HMGB1外排增加4.3倍（WB检测）；
- ATP分泌量上升3.5倍（荧光素酶法）；
- 增强树突状细胞（DC）成熟（CD86表达上调2.1倍）。
临床转化潜力
1. 生物标志物开发
- 血浆中p21CIP1蛋白水平可作为疗效预测标志物（AUC=0.89）；
- 线粒体DNA拷贝数与治疗反应呈负相关（r=-0.76，p=0.003）。
2. 联合方案优化
- 纳米颗粒递送系统（DTX-NPs）可提高药物肿瘤蓄积量2.8倍；
- 脉冲式给药策略（48h给药/72h停药）增强疗效并降低毒性。
3. 耐药逆转策略
针对可能出现的BCL-2家族蛋白突变，研究提出：
- 三联方案（Voxtalisib+Navitoclax+Venetoclax）可恢复敏感性；
- 表观遗传调节剂（如HDAC抑制剂）增强p53乙酰化水平。
结论
本研究通过系统筛选与机制解析，确立了Voxtalisib与Navitoclax联用作为黑色素瘤治疗新策略。该方案通过诱导衰老与触发凋亡的双重机制，有效克服耐药性，并在多种模型中展现疗效。研究不仅深化了对肿瘤细胞衰老调控的理解，更为临床转化提供了科学依据与实施路径。未来，需在更大规模临床试验中验证其安全性与有效性，并探索基于生物标志物的精准用药策略。
表1 药物联用方案在不同黑色素瘤细胞系中的活性比较
| 细胞系 | BRAF状态 | 单药Navitoclax IC50(μM) | 单药Voxtalisib IC50(μM) | 联用IC50(μM) | 协同指数(CI) |
|---|---|---|---|---|---|
| A375 | V600E突变 | 15.2±2.1 | 8.5±1.3 | 3.8±0.7 | 0.32 |
| SK-MEL-28 | V600E突变 | 18.7±2.6 | 12.3±1.8 | 5.1±0.9 | 0.38 |
| MeWo | 野生型 | 22.4±3.1 | 15.6±2.2 | 6.8±1.2 | 0.41 |
| WM266-4 | V600E突变 | 16.9±2.3 | 9.8±1.4 | 4.2±0.8 | 0.35 |
| UACC-257 | 野生型 | 20.1±2.8 | 14.2±2.0 | 6.2±1.1 | 0.39 |
| 名称 | 货号 | 规格 |
| BD OptiBuild™ BUV496 Rat Anti-Mouse CD8b | 741127 | 50ug |
| BD Pharmingen™ PE Mouse IgG1, κ Isotype Control | 555749 | 100Tst |
| BD Pharmingen™ PE Mouse Anti-Human CD86 | 555658 | 100Tst |
| BD Pharmingen™ PE Mouse Anti-Human CD86 | 560957 | 25Tst |
