蛋白质组学样品处理方法

蛋白质组学研究作为后基因组时代的核心领域，已成为揭示生命活动规律的关键突破口。本文系统综述了蛋白质样品前处理的技术体系，重点围绕疏水性蛋白、极性蛋白、高丰度/低丰度蛋白的差异化处理策略，以及干扰物质清除和质谱兼容性染色后处理等关键环节展开技术解析。

1. 难溶蛋白质的增溶策略

天然蛋白质固有的低溶解特性及其与杂质的非共价相互作用，构成了全蛋白组深度覆盖的技术瓶颈。现代增溶方案的核心在于通过化学干预破坏蛋白多聚体的分子内作用力，实现亚基解离与表面特性重塑。典型增溶体系包含：

(1) 离液剂体系：5-9 M尿素通过竞争性水合作用破坏蛋白质二级结构，诱导部分展开并暴露电荷基团以增强溶解性。需注意高温条件下尿素可水解生成氰酸盐（CNO⁻），导致氨基甲酰化修饰，故操作温度应严格控制在37℃以下。联合应用硫脲可形成协同增溶效应，但需配套使用两性电解质载体（如两性霉素B）以清除硫氰酸盐副产物。

(2) 表面活性剂体系：针对膜相关蛋白的提取，表面活性剂选择至关重要。离子型去污剂（如SDS）虽对疏水蛋白溶解效果显著，但其强变性作用与电荷屏蔽效应限制了在非变性电泳（如BN-PAGE）及等电聚焦中的应用。两性离子型去污剂（CHAPS、ASB-14）和非离子型去污剂（Triton X-100）因保留天然构象的能力，成为膜蛋白组学研究的首选试剂，常用浓度范围1%-4%（w/v）。

(3) 氧化还原调控：二硫苏糖醇（DTT）和三丁基膦（TBP）通过断裂二硫键实现蛋白解聚，需注意还原电位控制以避免过度还原导致的亚基解离。

当前膜蛋白组学研究的核心挑战仍在于突破脂筏复合物的溶解极限。新型双极性溶剂体系（如含氟表面活性剂）及纳米盘技术的开发，为破解该技术瓶颈提供了新方向。增溶体系的优化需兼顾溶解效率与蛋白天然构象保留，通过响应面法优化试剂配比（如尿素/硫脲摩尔比、CHAPS浓度、DTT浓度三因素三水平实验），可实现溶解度与结构完整性的平衡。

2. 可溶性蛋白质的纯化策略

难溶蛋白经增溶处理转化为可溶状态后，样品中残留的缓冲体系、盐类、脂质、多糖、核酸及去污剂等杂质仍构成显著干扰。这些污染物可通过以下机制影响下游分析：

盐离子诱导蛋白沉淀或聚集，改变溶液离子强度
脂质-蛋白复合物降低溶解度并干扰等电点测定
多聚糖与核酸堵塞凝胶孔隙，导致电泳条带扭曲或聚焦时间延长
残留去污剂影响质谱电离效率及肽段碎裂模式

杂质清除技术体系

(1) 脱盐与缓冲液置换

超滤法：基于分子量截留的切向流过滤技术，通过中空纤维膜（MWCO 5-30 kDa）实现盐分去除与蛋白浓缩。相较于透析法，其优势在于处理时间缩短（<30 min vs >4 h）且蛋白回收率提高（>85%）。
凝胶过滤层析：利用Sephadex G-25等短柱实现盐分去除与蛋白复性同步，特别适用于变性蛋白的折叠恢复。
固相萃取（SPE）：通过反相或离子交换吸附剂选择性保留蛋白，配合梯度洗脱实现深度净化。

(2) 脂质清除

有机溶剂萃取：采用氯仿/甲醇混合体系（2:1 v/v）进行液-液分配，可去除>90%的关联脂质。需注意低温操作（-20℃）以防止蛋白变性。
亲和层析：利用脂质结合蛋白（如脂质运载蛋白）或金属螯合配体进行特异性捕获。

(3) 核酸与多糖去除

核酸酶消化：Benzonase核酸酶（50 U/mL，37℃，1 h）可降解痕量核酸至<50 bp，配合后续超滤去除酶蛋白。
阴离子交换层析：DEAE或Q型填料在pH 8.0条件下可选择性吸附带负电的多糖及核酸。

(4) 去污剂清除

离子对反相色谱：C4/C8柱配合三氟乙酸（TFA）流动相，可实现SDS（临界胶束浓度8 mM）的完全去除。
亲和层析：针对CHAPS等两性离子去污剂，可采用苯基硼酸配体进行特异性吸附。
丙酮沉淀：在-20℃条件下，通过逐级添加预冷丙酮（4倍体积）实现去污剂与蛋白的共沉淀，适用于大规模样品处理。

技术优化方向

当前研究聚焦于开发集成化处理平台，如结合超滤-层析联用系统，可实现脱盐、去污剂清除与蛋白浓缩的自动化流程。新型纳米材料（如石墨烯氧化物）在痕量污染物吸附领域展现出应用潜力，其高比表面积（>200 m²/g）可显著提升清除效率。

3. 高丰度蛋白的去除与低丰度蛋白的富集策略

在蛋白质组学研究中，高丰度蛋白（如白蛋白、免疫球蛋白）的存在会显著抑制低丰度蛋白的检测灵敏度，其动态范围压缩效应可导致重要生物标志物的信息丢失。以血浆/血清为例，其蛋白组成中前10种高丰度蛋白占比超90%，形成典型的"大蛋白压制"现象。因此，建立高效的蛋白分馏体系成为提升组学覆盖度的核心技术需求。

高丰度蛋白去除技术体系

(1) 亲和去除法：

商业试剂盒（如Bio-Rad Aurum Serum Protein Mini Kit）采用抗原-抗体特异性结合原理，通过琼脂糖基质偶联的抗体阵列实现白蛋白、IgG等目标蛋白的靶向清除，回收率可达70-85%。
改进策略：联合应用多种抗体柱（如Albumin/IgG Depletion Resin）可实现多组分同步去除，但需注意非特异性吸附导致的蛋白损失（<15%）。

(2) 有机溶剂沉淀法：

丙酮/TCA沉淀：在-20℃条件下通过脱水作用诱导蛋白沉淀，适用于非特异性去除高丰度蛋白，但需优化溶剂比例（通常4:1 v/v）以平衡去除效率与蛋白活性保留。
硫酸铵分级沉淀：利用盐析效应实现蛋白分步沉淀，通过调节硫酸铵饱和度（20-80%）可定向富集特定等电点范围的蛋白组分。

低丰度蛋白富集技术路径

(1) 亚细胞器分离技术：

差速离心法：通过系列离心步骤（1000×g→10,000×g→100,000×g）实现细胞器分级，配合蔗糖/碘克沙醇密度梯度离心可获得高纯度亚细胞组分（如线粒体、内质网）。
免疫磁珠分选：偶联线粒体标志蛋白抗体（如Tom20）的磁珠可实现线粒体蛋白的高效富集，纯度可达90%以上。

(2) 层析分离技术：

离子交换层析（IEX）：在pH梯度条件下根据蛋白等电点差异实现分离，适用于带电蛋白的富集。
疏水相互作用层析（HIC）：利用高盐缓冲液暴露蛋白疏水 patch，通过苯基或丁基配基实现选择性保留。
尺寸排阻层析（SEC）：基于流体力学半径差异进行分离，特别适用于蛋白复合物的解聚与单体富集。

(3) 化学富集策略：

- 聚乙二醇（PEG）沉淀：通过分子拥挤效应诱导低丰度蛋白选择性沉淀，优化PEG分子量（6000-8000 Da）和浓度（3-5%）可显著提升富集倍数（>10倍）。
- 氯仿/甲醇沉淀：适用于膜蛋白的选择性富集，通过破坏脂筏结构释放关联蛋白，回收率可达60-70%。
前沿技术进展
当前研究聚焦于多维分馏平台的构建，如将亲和去除、离子交换与反相层析串联，可实现超过5000种蛋白的深度覆盖。单细胞蛋白质组学的发展推动了微流控芯片技术的集成应用，通过纳升体积反应体系实现单细胞水平的低丰度蛋白富集（检测限<100 copies/cell）。

4. 质谱鉴定前蛋白质样品的制备流程优化

凝胶电泳分离的蛋白斑点（条带）需经系统化前处理方可满足质谱分析要求，其制备流程涵盖脱色、变性蛋白还原、酶解位点暴露及肽段提取等关键步骤。

银染胶体脱色体系

银染胶体的脱色通常采用30 mmol/L铁氰化钾（K₃Fe(CN)₆）与100 mmol/L硫代硫酸钠（Na₂S₂O₃）的等体积混合溶液。该氧化还原体系通过以下机制实现银染颗粒的溶解：

Fe³⁺介导的电子转移反应破坏银纳米颗粒结构
S₂O₃²⁻配位作用促进银离子释放
反应终点需通过UV-Vis光谱监测（λ=470 nm，OD<0.05）以避免过度脱色导致的蛋白损失。

考马斯亮蓝脱色方案

考染胶体的脱色推荐使用50 mmol/L碳酸氢铵（NH₄HCO₃）配制的50%乙腈（ACN）溶液。该体系通过以下机制实现染料脱附：

乙腈诱导的胶体收缩效应破坏染料-蛋白复合物
碳酸氢根离子（HCO₃⁻）提供弱碱性环境（pH 8.0）促进染料解离
脱色效率可通过循环操作优化（3×15 min超声处理），直至胶块恢复无色透明状态。

蛋白还原与烷基化处理

(1) 还原反应：采用10 mmol/L二硫苏糖醇（DTT）的100 mmol/L NH₄HCO₃溶液（37℃，60 min），通过巯基-二硫键交换反应断裂蛋白内及蛋白间的二硫键，还原效率可达95%以上。

(2) 烷基化修饰：55 mmol/L碘乙酰胺（IAA）的100 mmol/L NH₄HCO₃溶液在暗处（避光）处理30 min，实现半胱氨酸残基的烷基化修饰，有效防止氧化还原循环导致的蛋白重新折叠。

酶解前处理与肽段提取

(1) 脱水步骤：100% ACN室温振荡处理（5 min）实现胶粒脱水，配合真空离心浓缩（30 min，45℃）完成蛋白固定化。

(2) 酶解条件优化：

胰蛋白酶（Trypsin）溶液（12.5 ng/μL，50 mmol/L NH₄HCO₃配制）4℃孵育60 min实现胶内渗透平衡
补充50 mmol/L NH₄HCO₃维持酶解体系pH稳定性
超声辅助提取（15 min，20 kHz）联合TFA-ACN溶液（0.1% TFA/60% ACN）实现肽段高效溶出

技术挑战与发展方向

当前蛋白质组学样品制备仍面临以下技术瓶颈：

膜蛋白及极性蛋白的回收率偏低（<40%），需开发新型去污剂体系（如磺基甜菜碱类）
糖基化蛋白的完整N-糖链保留仍依赖PNGase F酶解条件的精细调控
磷酸化蛋白的富集需联合使用TiO₂/ZrO₂金属亲和层析与富集前稳定化处理

未来技术突破将聚焦于：

微流控芯片集成化制备平台的开发（实现纳升级样品处理）
人工智能辅助的制备条件优化（通过机器学习预测最佳试剂配比）
新型纳米材料的应用（如MOFs材料在磷酸化肽段富集中的突破）

蛋白质组学样品制备技术的持续革新，将为揭示疾病标志物、药物靶点及蛋白翻译后修饰网络提供关键技术支撑。

名称	货号	规格
蛋白组学前处理试剂盒	abs50141-48T	48T
血浆低丰度蛋白富集试剂盒	abs9918-25T	25T
蛋白组学前处理试剂盒	abs50141-48T	48T
重组赖氨酰内切酶（质谱级）	abs90145-20μg×5	20μg×5