四色多重荧光免疫组化技术

 

前言

在临床病理诊断与基础科学研究领域，针对同一组织样本玻片开展多参数生物标志物检测的需求日益凸显。该技术体系可同步解析多重靶标蛋白的表达分布特征、定量水平差异及空间定位关系，从而实现多维生物学信息的整合分析。其中，基于荧光信号多重标记的免疫组化技术（multiplex immunohistochemistry, mIHC）已成为实现这一目标的核心工具。在临床转化层面，该技术通过构建蛋白表达谱系为疾病精准分型、预后风险分层及靶向治疗决策提供关键分子依据；在基础研究领域，其应用已深入肿瘤发生发展机制解析、复杂免疫微环境重塑过程探究及新型治疗靶点发现等前沿方向。典型的多靶标荧光免疫组化检测可通过荧光信号的多重标记实现精准的空间共定位分析（技术原理示意图详见附图），为揭示疾病异质性及分子调控网络提供重要技术支撑。

 

 

 

01 多重荧光免疫组化原理

多重荧光免疫组化技术依托酪胺信号放大系统（Tyramide Signal Amplification, TSA）实现免疫荧光信号的级联扩增。该技术核心在于利用辣根过氧化物酶（HRP）催化过氧化氢氧化修饰酪胺分子，使荧光素标记的酪胺衍生物与靶蛋白邻近的氨基酸残基（如色氨酸、组氨酸及酪氨酸）发生共价结合，从而在抗原-抗体复合物局部形成高密度荧光标记层，显著提升组织原位染色的信号强度与检测灵敏度。

 

 

在进行多靶标荧光标记时，通过迭代执行以下步骤实现多重染色：首轮标记完成后，对样本实施抗原修复处理（Heat-Induced Epitope Retrieval, HIER），有效剥离非共价结合的抗体-荧光复合物，而共价结合的荧光信号分子仍稳定锚定于靶蛋白位点。随后引入第二种特异性一抗进行孵育，经洗涤后采用不同荧光通道的标记试剂完成第二靶标的信号沉积。通过循环执行“标记-洗脱-再标记”操作流程，可系统性构建多参数荧光标记图谱，最终实现单个组织切片中数十种生物标志物的空间共定位解析。

 

02 实验操作基本流程

 

多重荧光免疫组化实验操作涉及多步骤精密调控，其技术流程具有显著的循环迭代特征。核心操作模块包括：

1. 组织前处理：通过二甲苯梯度脱蜡及梯度乙醇复水恢复组织通透性，为抗原暴露奠定基础；
2. 抗原表位修复：采用热诱导表位修复（Heat-Induced Epitope Retrieval, HIER）技术，利用柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）或EDTA缓冲液（pH 9.0）在95~98℃条件下实现蛋白构象重塑，确保隐蔽抗原表位充分暴露；
3. 非特异性封闭：使用5% BSA或动物血清在37℃条件下封闭1小时，阻断非特异性蛋白结合位点；
4. 多靶标迭代染色：
   • 一抗孵育：4℃过夜孵育特异性一抗（如CD3、CD8、PD-L1等），保障高亲和力结合；
   • 二抗-TSA复合物标记：HRP标记的二抗与荧光素-酪胺复合物结合，经TSA信号放大系统实现荧光信号沉积；
   • 抗原修复-抗体洗脱循环：每轮标记后实施HIER处理（95℃, 15分钟），配合0.1% Tween-20洗脱液实现非共价结合抗体的完全剥离，同时保留共价结合的荧光信号；
5. 核复染与封片：最终轮次染色后采用DAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole）进行细胞核复染，并使用抗荧光淬灭封片剂延长成像观察周期。

该流程通过精密控制抗原-抗体反应动力学及信号放大参数，支持在单张组织切片中实现≥6种生物标志物的空间共定位分析，为肿瘤微环境解析等复杂研究提供关键技术支撑。

 

03 实验前准备及注意事项

01 样本及切片准备

1. 石蜡切片预处理：需经65℃恒温烤片2小时以确保组织牢固附着，防止后续操作中脱片；
2. 切片质量要求：组织切片需满足平整度标准（褶皱率＜2%），无机械损伤及污染物残留；
3. 切片厚度优化：常规组织推荐3 μm厚度，针对脾脏、淋巴结等高细胞密度组织建议采用1~2 μm超薄切片以提升成像分辨率。若3 μm切片出现核结构丢失或细胞排列疏松现象，可适度调整至4~5 μm厚度。

02 抗体选择

1. 靶标信息验证：实验前需通过Human Protein Atlas等权威数据库确认靶蛋白表达谱系及亚细胞定位特征；
2. 抗体质量管控：优先选用经mIHC或IHC-P验证的高特异性抗体，重点关注种属交叉反应性、推荐工作浓度（建议进行1:50~1:500梯度预实验）、单抗/多抗属性、载体蛋白修饰状态（需选择无BSA/甘氨酸修饰产品）及适配抗原修复条件；
3. 多重染色适配性：需确保各抗体间无表位竞争，且宿主种属与二抗匹配（如鼠源一抗需配用抗鼠IgG二抗）。

03 荧光染色试剂

1. 多色试剂盒选型：根据靶标数量选择4~8色荧光标记系统，申挚医疗提供的四/五/六/七色多重荧光试剂盒（含Opal系列荧光染料、通用型二抗、DAPI及抗淬灭封片剂）可实现跨通道信号兼容；
2. 染色方案优化：需通过预实验确定最佳荧光素-抗体配对组合及染色顺序，重点关注光谱重叠最小化策略，并建立标准化曝光时间参数库。

04 其他辅助试剂和仪器

1. 关键耗材配置：
   • 脱蜡系统：环保型脱蜡试剂（替代二甲苯）与梯度乙醇（100%、95%、70%浓度）；
   • 抗原修复液：柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0，适用于热修复）或Tris-EDTA缓冲液（pH 9.0，适用于酶修复）；
   • 阻断体系：3% H₂O₂溶液（灭活内源性过氧化物酶）、TBST/PBST洗液（含0.05% Tween-20）。
2. 核心设备要求：
   • 热修复装置：需配置温度精确可控的微波炉或恒温水浴锅（温度波动范围≤±1℃）；
   • 成像系统：荧光显微镜需配备与所选荧光染料匹配的激发/发射滤光片组，多色成像时建议采用光谱拆分算法（以消除通道间信号串扰。

 

04 实验设计与规划

01 实验对照

科学严谨的对照设计是保障多重荧光免疫组化实验可重复性的核心要素，其功能涵盖质量监控与异常溯源双重维度：

1. 阳性对照（Positive Control）：
   • 选用已知表达目标抗原的标准组织（如扁桃体组织作为CD20阳性对照），同步开展平行检测。若结果呈阳性，则验证实验体系（包括试剂效价、仪器状态及操作流程）的有效性；若呈阴性，需系统排查抗体效价衰减、二抗-荧光素偶联失效或操作失误（如抗原修复不足）。
2. 阴性对照（Negative Control）：
   • 采用明确不表达靶抗原的组织（如野生型小鼠脑组织作为人类特异性抗体对照），排除非特异性结合干扰。若结果呈阳性，则提示存在抗体交叉反应、内源性生物素污染或自发荧光背景，需优化封闭条件或更换抗体种属来源。

02 预实验

预实验阶段通过系统性参数优化，可显著提升多重荧光标记实验的成功率与数据质量，具体策略如下：

1. 单标体系验证：
   • 对每支候选抗体执行梯度稀释实验（1:50~1:2000），通过免疫组化（IHC）或免疫荧光（IF）确定最佳工作浓度（通常为线性范围内信噪比峰值点）。
   • 结合目标组织类型评估抗原表达丰度，为后续多标配色方案提供依据。
2. 多标配色策略：
   • 根据单标荧光强度与靶标丰度实施反向匹配，将高丰度抗原（如CD45）与低亮度荧光素组合，低丰度抗原（如PD-1）与高亮度荧光素组合，以平衡整体信号强度。
3. 染色顺序优化：
   • 综合考虑表位热稳定性（如磷酸化表位对HIER敏感度）、抗原修复兼容性（柠檬酸盐 vs. EDTA缓冲液）及抗体种属交叉反应，建立迭代染色顺序矩阵。例如，优先标记对热处理敏感的抗原，后续轮次采用温和修复条件。
4. 小规模方案验证：
   • 选取3~5例代表性样本进行手工预染，通过光谱拆分成像系统评估通道间串扰率（要求＜5%）。确认方案稳定后，可过渡至自动化平台进行高通量实验。

 

05 实验操作步骤及注意事项

01 实验操作基本步骤

1. 脱蜡水合：
   • 依次将切片浸入环保型脱蜡试剂（或二甲苯）3次（每次10分钟），随后经梯度乙醇复水（100%乙醇→95%乙醇→70%乙醇，各5分钟），最终以去离子水浸洗3分钟以恢复组织通透性。
2. 抗原热修复：
   • 预热柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）或EDTA缓冲液（pH 9.0）至97℃，将切片完全浸没于修复液中保温25分钟，自然冷却至室温后，以3% H₂O₂溶液室温处理10～15分钟以灭活内源性过氧化物酶，随后用TBST缓冲液漂洗3次（每次3分钟）。
3. 非特异性封闭：
   • 滴加5% BSA或动物血清封闭液覆盖组织区域，于保湿盒内37℃孵育10分钟以阻断非特异性结合位点。
4. 一抗孵育：
   • 倾去封闭液，滴加按预实验优化浓度稀释的一抗工作液，4℃过夜孵育（≥16小时）或室温孵育1小时，随后以TBST漂洗3次（每次3分钟）。
5. 二抗结合：
   • 滴加HRP标记的通用型二抗（如抗鼠/兔IgG），37℃保湿孵育15分钟，TBST漂洗3次（每次3分钟）。
6. 荧光信号放大：
   • 滴加TSA荧光染料工作液（按1:100～1:500稀释），37℃避光孵育10分钟，TBST漂洗3次（每次3分钟）。
7. 迭代染色循环：
   • 重复步骤③至⑥，依次完成后续靶标的标记，每轮染色后需严格验证信号残留量（要求荧光强度衰减率＜5%）。
8. 核复染与封片：
   • 滴加DAPI工作液（1 μg/mL）复染细胞核5分钟，经TBST漂洗后，以抗荧光淬灭封片剂（含ProLong Gold成分）封片，并用无色指甲油加固盖玻片边缘。
9. 成像采集：
   • 采用光谱成像系统（如Akoya Biosciences CODEX）进行多通道荧光采集，通过线性解混算法分离重叠信号，最终生成高动态范围图像。

02 注意事项

1. 湿度控制：
   • 全程操作需在湿盒或保湿暗盒内进行，防止组织干燥导致的非特异性结合及信号衰减（推荐使用37℃恒温湿盒维持环境湿度＞80%）。
2. 抗原修复优化：
   • 修复液需预热至目标温度（95～98℃），修复过程中确保组织完全浸没（液面需高出切片2 mm以上），修复后禁止急速冷却（建议采用梯度降温法：97℃→65℃→室温）。
3. 修复液选择策略：
   • 针对难修复抗原（如核内转录因子），可优先选用EDTA缓冲液（pH 9.0）并延长修复时间至30分钟；对于膜蛋白标记，则推荐柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）以减少蛋白抽提。
4. 疏水屏障构建：
   • 使用免疫组化笔绘制疏水边界时，需距离组织边缘≥3 mm，避免修复液渗透导致组织脱落或背景染色。
5. 封片质量控制：
   • 封片剂需完全覆盖组织区域（推荐用量5～8 μL/cm²），封片后置于4℃避光保存，并于72小时内完成成像以避免荧光淬灭（淬灭速率：Alexa Fluor 488＞Cy3＞Cy5）。

四色多重荧光免疫组化染色试剂盒（鼠兔通用二抗）

在当代生命科学研究中，解析组织微环境内多靶标蛋白的空间共定位与动态互作网络，已成为揭示疾病发生发展机制的核心策略。上海优宁维生物科技股份有限公司推出的四色多重荧光免疫组化染色试剂盒（货号：abs50012），依托酪胺信号放大技术与光谱拆分成像系统，为肿瘤免疫微环境、神经退行性疾病及发育生物学等领域的研究提供了高灵敏度、高特异性的解决方案。

该试剂盒采用迭代式染色策略，结合HRP催化酪胺-荧光素共价标记技术，实现单张切片上四色荧光信号的精准沉积。其技术核心在于酪胺信号放大系统，通过辣根过氧化物酶催化过氧化氢氧化修饰酪胺分子，使荧光素标记的酪胺衍生物与靶蛋白邻近的氨基酸残基发生共价结合，从而在抗原-抗体复合物局部形成高密度荧光标记层，显著提升组织原位染色的信号强度与检测灵敏度。此外，试剂盒采用鼠兔通用二抗设计，兼容小鼠与兔源一抗体系，避免多轮染色中二抗交叉反应，简化实验流程。配套荧光染料（如Alexa Fluor 488、Cy3、Alexa Fluor 555、Cy5）激发/发射光谱彼此分离，可通过光谱成像系统实现无串扰信号采集。

 

 

产品包含荧光染料工作液、鼠兔通用二抗、DAPI核复染剂、抗荧光淬灭封片剂、抗原修复液与洗脱液等关键组分。荧光染料工作液提供四种预优化浓度的荧光素-酪胺复合物，覆盖可见光至近红外光谱范围；鼠兔通用二抗为HRP标记的抗鼠/兔IgG二抗，经亲和层析纯化，批间差异小于5%；DAPI核复染剂支持细胞核精准定位；抗荧光淬灭封片剂含ProLong Gold成分，延长荧光信号半衰期至72小时以上；抗原修复液与洗脱液则保障表位暴露与信号剥离效率。

在应用领域方面，该试剂盒在肿瘤微环境解析中可同步检测肿瘤细胞与免疫细胞的空间分布，揭示免疫逃逸机制，并量化肿瘤新生血管与周细胞的共定位关系，评估抗血管生成治疗疗效；在神经科学研究中，可解析阿尔茨海默病模型中Aβ斑块与小胶质细胞的互作模式，并追踪神经发育过程中轴突导向因子与突触标记物的动态表达谱系；在免疫学研究中，可构建免疫细胞亚群与细胞因子的空间表达图谱，解析自身免疫性疾病发病机制。

 

实验操作需严格遵循标准化步骤以确保结果可靠性。组织前处理包括石蜡切片经环保脱蜡试剂处理后，通过梯度乙醇复水恢复组织通透性，并采用热诱导表位修复技术，利用柠檬酸盐缓冲液在97℃条件下实现蛋白构象重塑。迭代染色循环包含一抗孵育、HRP标记二抗结合及TSA荧光染色，每轮染色后需实施抗原修复-洗脱处理，配合洗脱液实现非共价结合抗体的完全剥离。成像与数据分析则采用光谱成像系统进行多通道荧光采集，通过线性解混算法分离重叠信号，并使用图像分析软件定量荧光强度、计算共定位系数。

上海优宁维生物科技为产品提供全方位保障，包括严格质检，确保每批次试剂盒经ELISA法验证，荧光强度CV值小于8%、批间一致性大于95%；提供技术支持，协助客户优化检测方案；以及定制化服务，根据特殊需求调整荧光染料组合或检测靶标数量，降低科研成本。

四色多重荧光免疫组化染色试剂盒（鼠兔通用二抗）以其卓越的检测性能、广泛的应用场景及可靠的质量保障，成为解析组织微环境复杂性的关键工具。随着单细胞测序与空间组学技术的发展，该试剂盒可进一步结合多维度数据，深入挖掘细胞间通讯网络与分子调控机制，为疾病机制研究及药物靶点开发提供关键支持。上海优宁维生物科技股份有限公司将持续迭代产品性能，助力科研工作者在生命科学领域取得突破性成果。

该产品6.18活动大促中

名称	货号	规格
四色多重荧光免疫组化染色试剂盒（鼠兔通用二抗）	abs50012-20T	20T
四色多重荧光免疫组化染色试剂盒（鼠兔通用二抗）	abs50012-50T	50T
四色多重荧光免疫组化染色试剂盒（鼠兔通用二抗）	abs50012-100T	100T

 

6.18活动大促，更多商品请了解

 

 

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