A Dual-Targeting Circular Aptamer Strategy Enables the Recognition of Different Leukemia Cells with Enhanced Binding Ability

期刊：Angewandte Chemie International Edition

影响因子：IF = 16.823

作者单位：湖南大学化学化工学院

文章链接：https://doi.org/10.1002/anie.202109500

研究摘要：

当前，单价核酸适配体在肿瘤诊疗中的应用仍面临多重挑战，包括因肿瘤细胞表面靶标受体表达丰度不足导致的识别效率低下，以及单一靶向策略对肿瘤异质性覆盖范围有限等问题。

本研究设计并构建了一种双靶向环形核酸适配体（Dual-Targeting Circular Aptamer, DTCA），其通过空间构象优化可同时结合细胞膜表面两种特异性生物标志物，显著强化适体-受体相互作用动力学，从而提升对靶标细胞的结合亲和力与内化效率。该双靶向设计不仅有效突破了传统单价适配体的识别局限，显著扩展了对不同白血病亚型细胞的识别谱系，还依托环形拓扑结构的抗核酸酶降解特性，使DTCA在复杂生物介质（如血清）中的稳定性较线性结构提升3倍以上。进一步地，通过将DTCA骨架中的4个胸腺嘧啶（T）定点替换为5-氟脱氧尿嘧啶（5-FdU），成功开发出具有肿瘤细胞靶向杀伤功能的药理型环形核酸适配体（5-FdU-DTCA）。实验证实，5-FdU-DTCA可通过共价结合并干扰肿瘤细胞DNA合成通路，对多种白血病细胞系展现显著细胞毒性（IC₅₀=0.21~0.87 μM），而对正常造血细胞毒性可忽略（>20 μM），实现了高选择性的肿瘤细胞杀伤。此外，该双靶向环形核酸策略在活体肿瘤模型中亦表现出优异的靶向富集能力与信号背景比，为肿瘤精准诊疗一体化提供了新型分子工具。

The role of SARS-CoV-2 ORF7a in autophagy flux disruption: implications for viral infection and pathogenesis

期刊：Autophagy

影响因子：IF = 13.391

作者单位：山东师范大学生命科学学院

文章链接：https://doi.org/10.1080/15548627.2022.2084686

研究摘要：

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）引发的全球性流行病，对人类健康及公共卫生安全构成重大威胁。细胞自噬（Autophagy）作为真核生物进化保守的溶酶体依赖性降解途径，在病毒复制周期及宿主-病原体互作网络中扮演关键调控角色。尽管现有研究证实SARS-CoV-2感染可诱导宿主细胞自噬反应，但其具体调控机制尚未完全阐明。

本研究发现，SARS-CoV-2编码的辅助蛋白ORF7a通过激活AKT-MTOR-ULK1信号轴启动自噬级联反应，表现为自噬标志物LC3-II表达水平显著上调及自噬体胞内蓄积。进一步机制研究揭示：

ORF7a依赖性自噬启动：通过靶向ORF7a的短发夹RNA（shRNA）沉默策略可有效阻断SARS-CoV-2诱导的自噬通量增加；
不完全自噬表型特征：ORF7a蛋白虽能通过AKT-MTOR-ULK1通路激活自噬起始，但最终导致自噬体-溶酶体融合障碍；
分子机制解析：ORF7a通过激活Caspase 3蛋白酶，特异性切割可溶性NSF附着蛋白受体（SNARE）蛋白SNAP29的天冬氨酸30位点（D30），导致SNAP29蛋白水平下调，进而破坏自噬体与溶酶体膜融合必需的SNARE复合物组装；
病毒复制促进效应：SARS-CoV-2利用ORF7a诱导的不完全自噬环境，通过阻断自噬降解通路实现子代病毒粒子的胞内积累与释放增强。

综上，本研究首次系统阐明ORF7a通过双重调控机制（激活自噬起始/抑制自噬体成熟）诱导不完全自噬，进而促进病毒复制的分子路径。该发现不仅深化了对冠状病毒-宿主互作网络中自噬调控异质性的认知，更为靶向自噬通路的新型抗病毒策略开发提供了关键理论依据。

关于CCK-8

细胞增殖与毒性评估是生命科学研究的基石性实验，传统MTT法因操作繁琐、产物不溶等局限性已难以满足现代药物筛选及细胞功能研究的需求。上海优宁维生物科技股份有限公司推出的CCK-8超强型试剂盒（货号：abs50003-5000T-GP），以2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐（WST-8）为核心显色底物，通过创新检测体系设计，实现了细胞活性分析的灵敏度、稳定性与操作便捷性的突破，为肿瘤药敏试验、干细胞分化研究及毒理学评价提供了关键技术支持。

技术原理与核心优势

WST-8显色反应机制
WST-8是一种类MTT结构的四唑盐化合物，其分子结构中的硝基苯基与磺酸基团赋予其优异的水溶性及生物相容性。在电子耦合试剂1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）介导下，WST-8可穿透细胞膜进入胞质，被线粒体脱氢酶（如琥珀酸脱氢酶）催化还原为高度水溶性的橙黄色甲瓒产物（Formazan）。该反应具有以下特征：
- 定量相关性：生成的Formazan量与活细胞数量呈严格线性关系（R²>0.995），细胞增殖越活跃，溶液吸光度值（450 nm）越高；
- 毒性敏感性：细胞毒性物质通过抑制脱氢酶活性减少Formazan生成，吸光度降幅与细胞死亡率正相关；
- 光谱特性：最大吸收峰位于450 nm，与常规酶标仪兼容，支持96/384孔板高通量检测。
产品性能突破
- 超强型灵敏度：通过纳米微球载体技术提升WST-8胞内递送效率，最低可检测50个细胞/孔，较传统CCK-8试剂灵敏度提升4倍；
- 反应速率优化：标准检测周期缩短至30分钟（37℃），显著优于MTT法（4小时）及传统CCK-8试剂（1-2小时）；
- 抗干扰设计：配方中添加表面活性剂及金属离子螯合剂，有效消除血清蛋白（如BSA）及酚红指示剂的背景吸收干扰。

应用领域与技术价值

肿瘤药敏试验
在结直肠癌化疗药物筛选中，CCK-8试剂盒可精准评估5-氟尿嘧啶（5-FU）对HCT116细胞的IC₅₀值（0.87±0.12 μg/mL），其变异系数（CV=3.2%）显著低于MTT法（CV=12.7%），为个体化用药方案制定提供可靠数据支撑。
干细胞分化研究
通过动态监测诱导多能干细胞（iPSCs）向神经元分化过程中的细胞增殖曲线，CCK-8试剂盒可清晰解析增殖期（第3-5天）与分化期（第7-14天）的活性变化拐点，为干细胞命运调控机制研究提供量化指标。
纳米材料毒性评价
在石墨烯量子点生物安全性评估中，该试剂盒检测到浓度低至10 μg/mL的纳米材料即可引发A549细胞活性显著下降（P<0.01），其检测阈值较乳酸脱氢酶（LDH）释放法低一个数量级。

实验操作规范与质控要点

标准检测流程
- 细胞接种：按5×10³~1×10⁵细胞/孔密度接种于96孔板，设置空白对照（无细胞，仅培养基）；
- 药物处理：加入梯度浓度待测化合物，37℃孵育24~72小时；
- 显色反应：每孔加入10 μL CCK-8工作液，37℃避光孵育30分钟；
- 吸光度测定：采用酶标仪检测450 nm波长处光密度值（OD值），计算细胞存活率=（实验组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100%。
质量控制标准
- 批间差异：不同生产批次试剂的OD值CV值≤5%，保障实验可重复性；
- 稳定性验证：4℃避光保存条件下，试剂有效期长达18个月，开瓶后3个月内性能无衰减；
- 细胞兼容性：通过HEK293、HeLa、RAW264.7等12种常用细胞系验证，适用性广泛。

总结与展望

CCK-8超强型试剂盒通过WST-8显色体系的创新优化，建立了细胞活性检测的新标准，其高灵敏度、快响应特性与抗干扰能力为复杂生物学过程研究提供了精准工具。随着类器官培养及微流控芯片技术的兴起，该产品可进一步集成于三维细胞模型毒性评价平台，在药物发现与精准医疗领域展现更广阔的应用前景。上海优宁维生物科技股份有限公司将持续迭代产品性能，助力科研工作者破解细胞功能研究中的关键技术瓶颈。

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