流式细胞技术（Flow CytoMetry，FCM）是一项借助流式细胞仪得以实施的单细胞定量分析与分选技术。该技术整合了单克隆抗体、免疫细胞化学技术、激光以及电子计算机科学等多个领域的尖端成果。其工作原理聚焦于细胞分子层面，运用单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子开展多参数且快速的定量分析。它能够高效地分析数以万计的细胞，并且可从单个细胞中同步测定多个参数，具备分析速度快、精度高以及准确性优良等显著特性，堪称当代细胞定量分析领域的前沿技术。
在目前已发表的研究文献里，展示流式细胞术数据时使用频率最高的软件当属Flowjo软件。该软件能够绘制出精美的数据图形，功能丰富多样，不仅提供完善的流式数据手工圈门、自动计算补偿矩阵等常规分析功能，还具备诸多独特优势。本文将针对Flowjo软件的功能和插件展开详细介绍，引领你解锁流式数据处理的多种实用方法。
一、Flowjo的核心功能
1.数据导入与组织
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FlowJo具备直观的工作区界面，专注于流式细胞数据的高效组织与管理。该软件完美适配FCS格式数据文件的导入需求，用户可依托创建的工作区，实现对分析流程的便捷存储与规范化管理。
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操作步骤：启动FlowJo软件后，点击 “Add Samples...” 按钮精准定位并选取待处理的数据文件完成导入，或者采用直接拖拽的方式，将单一数据文件或包含多个文件的文件夹整体移至软件操作区域。这两种高效的操作模式最终均能达成一致的导入成效。
2.数据可视化 ： FlowJo 支持多种图形类型的可视化展示，涵盖了直方图、散点图以及双染色图等多种形式。用户在分析过程中，可通过调整坐标轴参数以及变换轴的缩放比例等操作来精准提取关键信息，并依据这些可视化图形执行有效的门控操作。
操作步骤如下： 在 FlowJo 软件界面中，通过双击操作打开已导入的数据文件，此时系统将自动生成并显示 FSC-SSC 图。若需对图形的坐标轴进行调整，用户可分别点击横纵坐标轴上的 “T” 图标，随后从弹出的选项菜单中选取 “Customize Axis...” 一项，进而进入坐标轴设置界面。在此界面中，对 “Scale” 一栏中的数值进行相应修改，即可灵活改变图形的坐标范围，从而实现对数据展示的精细化控制。
3. 荧光补偿
在多色流式细胞术实验中，不同荧光标记的发射光谱可能存在部分重叠，导致一个荧光通道检测的信号中混有其他荧光通道的信号，从而产生干扰。FlowJo 提供了强大的补偿功能，用于校正这种荧光溢出现象。用户可以选用内置的补偿矩阵，或者根据实验需求手动调整补偿参数。
操作步骤：
自动补偿调整：将样本导入 FlowJo 后，将所有单染管拖拽至 Compensation 组。选中 Compensation 组，点击菜单栏中的彩虹补偿选项。
此时，FlowJo 将弹出一个新的补偿界面，在该界面中，参数、样本、补偿名称、阴性对照和阳性对照需严格对应。若存在不对应情况，则需手动进行相应调整。接下来，点击 “AutoSpill/AutoSpread” 按钮，再点击 “View Matrix”，即可生成自动补偿矩阵。
在手动补偿调整方面，首先将样本导入 FlowJo，然后选中单染样品管对应的白色方框并双击打开。点击 “+” 号以添加需要进行补偿的通道。添加完成后，按住 “[M]” 键，将相关通道拖拽至 experiment 中。最后，在补偿矩阵的表格中输入具体的补偿数值，从而完成手动补偿调整。
4. 细胞周期与增殖分析
FlowJo 为细胞周期和增殖分析提供了全面的工具，简化了从数据导入到结果导出的每一步流程。凭借强大的门控和模型拟合功能，用户能够高效地完成复杂的生物学分析，并导出高质量的结果以供进一步研究或报告。
细胞周期分析：
将样本导入 FlowJo 后，首先需要将横纵坐标分别设定为 FSC 和 SSC，并通过门控圈选活细胞。随后，双击打开 cells 选项，将横纵坐标更改为 PI（A）和 PI（H），以圈选单细胞。选中 single cell 选项后，在 FlowJo 的 tools 界面中，点击 cell cycle 功能，将横坐标设定为 PI（A），软件将自动进行细胞周期的计算分析。
细胞增殖分析：
对于细胞增殖分析，同样先将样本导入 FlowJo，并将横纵坐标分别设定为 FSC 和 SSC，圈选活细胞。接下来，双击打开 cells 选项，将横纵坐标更改为 FSC（A）和 FSC（H）或 FSC（A）和 FSC（W），以圈选单细胞。选中 single cell 选项后，在 FlowJo 的 tools 界面中，点击 Proliferation Modeling 功能，将横坐标参数设定为实验中使用的荧光通道。利用未刺激的对照样本确定原代细胞（Generation 0）的荧光强度峰值，并根据实验观察到的分裂代数设置增殖峰的数目。通过调整 Ratio（子代荧光强度与母代的比率）和 CV（变异系数），优化拟合结果，从而得到准确的增殖指数（Proliferation Index），即增殖细胞占总细胞的比例。软件会自动计算并提供增殖指数，为用户提供了一个直观的增殖分析结果。
二、Flowjo的插件：数据分析师的“超能力加持”
1. 数据处理基石：给数据 “瘦身”
FlowAI FlowAI 是一款智能化分析工具，它运用先进的机器学习算法，能够自动识别和标注细胞群体，极大地减少了繁琐的人工操作，显著提高了分析的效率和准确性。FlowAI 可以智能地识别并剔除碎片、粘连细胞和死细胞，有效拯救受污染的样本。使用时，用户只需导入数据，右键点击样本并选择 “FlowAI”，设置好相应的阈值，即可自动生成详细的质控报告。
Downsample Downsample 插件主要用于平衡不同样本间的细胞数量，确保分析的公平性和合理性。它通过随机抽取细胞，将不同样本的细胞数量调整至同一数量级，从而消除因样本大小差异而带来的潜在偏差。操作简便，用户只需选中样本，点击 Downsample 插件，在弹出的对话框中确认后，选择一个样本作为参考，插件将自动对其他样本进行降采样处理。
2. 降维插件：高维数据至可视化美图的精妙转化
t-SNE
t-SNE，即 t- 分布随机邻域嵌入，它是从随机邻域嵌入（Stochastic Neighbor Embedding, SNE；Hinton and Roweis, 2002）这一算法衍生发展而来的，是一种功能强大的机器学习算法。其核心作用在于将复杂难解的高维数据精准地映射到我们更易观察的二维或三维空间之中。
在这一过程中，t-SNE 会巧妙地将数据转化为一幅幅精美的 “颜色泡泡” 图，这些泡泡以直观且生动的方式展示出细胞亚群的分布情况，使我们能够轻松地观察到细胞群体的分布特征以及聚类情况。
在 Flowjo 软件中，您可以轻松地找到 t-SNE 插件。选中目标数据集后，您需要根据实际情况合理设置降维的关键参数，例如困惑度、迭代次数等。一旦设置完成，插件便会快速启动并开始高效地工作，为您呈现出简洁明了、通俗易懂的可视化结果，极大地提高了数据分析的效率与准确性。
UMAP
UMAP，作为一种新兴的降维技术，由 McInnes 等人提出。虽说 UMAP 与 t-SNE 在输出结果上存在某种程度的相似性，然而，UMAP 技术在运算速度方面却有着显著的提升，更值得一提的是，它在强调局部结构的同时，也兼顾了全局结构，二者之间取得了相对更优的平衡，且其展示方式也更易于理解。
在 FlowJo 工作区中，我们首先需要右键点击目标细胞群体，然后选择 “Plugins”，接着找到并点击 “UMAP” 降维插件。随后，在弹出的窗口中对相应的参数进行配置。需要设置的参数主要包括 Input Parameters，如 number of neighbors（邻居数量）、minimum distance（最小距离）、number of components（成分数量）等。完成参数设置后，点击 “run” 按钮，插件就会开始运行，并最终生成降维后的数据。
3.聚类插件：自动圈门，告别手动“瞎猜”
FlowSOM
FlowSOM 是一款聚类与可视化工具，对于高维数据的分析大有助益。它如同拼接拼图一般，能自动将相似的细胞群体归拢一处，形成清晰明确的亚群，并可识别细胞亚群，以热图等形式直观呈现各亚群的特征。安装好插件后，在 Flowjo 的 Plugins 菜单下即可找到它。在 Flowjo 工作区中，右键选中目标细胞群体，选择“Plugins”，点击“FlowSOM”，在弹出的窗口中配置参数，设置参数涵盖 Input Parameters、SOM Grid Size、Number of Metaclusters 等，之后点击“run”，插件便会自动开启数据分析和处理流程。
Phenograph
Phenograph 是一种基于图论原理的聚类算法，它能够针对高维单细胞数据展开分析，将其精准划分为具有不同表型特征的亚群。该算法通过构建细胞之间的相似性图谱，借助社区检测算法对细胞进行分组操作，进而揭示细胞群体所蕴含的结构特征。在 Flowjo 工作区中，右键选中目标细胞群体，点击“Plugins”按钮，从列表中选择 Phenograph 插件；在 Phenograph 插件的设置界面里，对相关参数进行设置，其中关键参数涵盖 Input Parameters、Number of Neighbors (k)（邻居数量 k）、Distance Metric（距离度量方式）等，设置完成后点击“Run”按钮，Phenograph 插件便会自动对数据执行聚类分析任务。
总结：
FlowJo凭借其卓越的功能与丰富的插件库，为流式细胞数据分析打造了全方位的解决方案。从基础的数据可视化和门控分析，到高维数据的聚类、降维和比较分析，FlowJo均能精准契合研究人员的多样化需求。通过深度挖掘并合理运用其插件资源，研究人员不仅能显著提升数据分析的效率与准确性，更能深度剖析数据价值，为免疫学等众多生命科学领域的研究提供有力的技术支撑。
