外泌体纯化
外泌体（Exosome）是一种由多种细胞及体液分泌、富含 miRNA、mRNA 和蛋白质等生物分子的纳米级囊泡体，其直径介于 30 - 150nm 之间。外泌体既具备来源细胞的特异性特征，又因纳米级尺寸而易于穿透微小血管及各类病理细胞膜。基于这些独特属性，外泌体已在疾病诊断检测、治疗及药物递送等多领域展现出显著的应用潜力，成为近年来备受瞩目的新兴研究领域。
然而，尽管外泌体具有丰富的开发潜力，其临床应用进程却相对缓慢。当前主要面临两大技术瓶颈：其一是外泌体提取技术的标准化与产率优化；其二是精准区分外泌体与其他细胞外囊泡（尤其是功能性囊泡）的方法学难题。综上所述，外泌体提取和纯化工艺的优化仍是推动其临床应用发展的关键要素，亟待深入研究与突破。
外泌体存在于成分高度复杂的体液环境之中，这使得实现其高产量分离极具挑战性。目前，即便采用了处理能力较强的超速离心法这一传统“金标准”，该方法在实际应用中仍存在诸多不足，可能对后续分析造成不利影响。
鉴于不存在一种适用于所有样本来源的通用分离方法，科研人员已着手利用外泌体的多种物理化学及生化特性开发替代方案。迄今为止，学术界已报道了六类主要的外泌体分离策略，涵盖超速离心法、超滤法、免疫亲和捕获法、基于电荷中和的聚合物沉淀法、尺寸排阻色谱法以及微流控技术法。每种技术均展现出独特的性能特点与局限性，需根据具体研究需求进行合理选择与优化。
超速离心法
超速离心法被广泛视为外泌体分离的权威技术，并作为分离细菌、病毒及亚细胞结构等生物样本的常规手段。然而，尽管其凭借高处理效率而享有外泌体分离“黄金标准”的盛誉，该方法所制备的外泌体样本因携带高水平蛋白质聚集体与脂蛋白杂质，对外泌体的精确定量及功能研究造成显著干扰。
超速离心主要分为密度梯度离心法和差速超速离心法两大类别。差速超速离心法，亦称基础离心法或沉淀法，凭借操作简便成为最主流的外泌体分离途径。30余年来，该方法已被成功应用于从细胞培养液到血清、唾液、尿液乃至脑脊液等多元样本的外泌体提取。其原理基于在特定离心力条件下，依据颗粒的密度、尺寸及形态特征，依次分层沉淀样品中的各类细胞外组分。自1987年首次从网织红细胞培养基分离外泌体以来，该技术不断演进。至2006年，通过引入初始低速离心（如300g/10min）以去除大型生物颗粒杂质，随后依次施加2000g至100000g的逐步离心程序，可有效剔除细胞残骸、凋亡体及蛋白质聚集体等干扰物质，优化外泌体分离纯度。差速超速离心法的优势在于易于规模化放大，对操作人员专业素养要求相对宽松，且无需复杂的前期样本处理。
然而，由于细胞外环境的复杂性，差速超速离心法在分离过程中易将外泌体与其他具有相似物理特性的组分（如微囊泡、蛋白质聚集体和脂蛋白）共同沉淀在离心管底部，导致外泌体样本纯度较低，进而在下游功能分析等应用场景中产生不利影响。
密度梯度离心与速率梯度离心
密度梯度离心是为克服差速超速离心法低纯度局限而发展出的改良离心技术，目前已成为外泌体分离纯化的主流方案。常规操作中，首先在离心管内构建具有密度梯度（自下而上密度递减）的生物相容性介质层（如碘氧化物或蔗糖溶液），其密度范围需覆盖样品颗粒密度区间。随后将待分离样品置于介质层顶部，并延长离心时间。在离心力作用下，外泌体、凋亡体及蛋白质聚集体等细胞外组分会迁移至与自身密度匹配的等密度层位置。
密度梯度超速离心可显著提升外泌体样本纯度，满足下游高精度分析需求，其应用占比近年来持续攀升。但该方法纯度提升依赖于样品组分间密度差异。尽管能有效去除蛋白质聚集体等常见杂质，却难以区分与外泌体密度相近但尺寸各异的细胞外囊泡（如微囊泡）。为应对这一挑战，研究引入了移动区带密度梯度离心（速率区域离心）技术，通过协同利用颗粒尺寸与密度差异实现精准分离。
与传统密度梯度离心不同，移动区带离心所用介质密度低于样品组分临界密度，使得所有不溶性颗粒在长时间离心后最终沉降至管底。为精准控制分离过程，需精确设定离心时间，并在离心管底部预先加载高密度介质作为缓冲层，以避免外泌体过度沉淀。尽管密度梯度离心能显著降低杂质含量，但受限于样品装载量，且对设备及操作人员要求较高。此外，长时间高强度离心可能损伤外泌体结构与功能，不利于后续功能研究及药物开发等应用。针对此类问题，超滤与尺寸排阻色谱等替代技术可作为有效补充。
超滤法
超滤技术利用具有不同分子量截止值（MWCO）的超细纳米过滤膜，从临床样本或细胞培养基中分离细胞外囊泡，并依据粒径差异区分外泌体与其他囊泡结构。与耗时较长且需依赖复杂设备的超速离心法相比，超滤技术显著缩短了处理时间，降低了对特殊仪器的依赖，为经典超速离心策略提供了高效且经济的替代方案。尤为重要的是，通过灵活调整过滤膜孔径，超滤技术能够精准分类具有特定粒径范围的小细胞外囊泡（包括外泌体），从而实现对特定亚群的深入研究。
目前，两种较为成熟的超滤设备已得到广泛应用。第一种是串联配置的微滤器系统，该系统由两个串联的微滤器构成，尺寸排除限制约为20-200nm。在分离过程中，较大囊泡（如凋亡体及大部分微囊泡）被截留在200nm的过滤膜中，而直径介于20-200nm的囊泡则保留于底部，更小的颗粒（如蛋白质）则通过20nm微滤器排出。
顺序超滤作为一种流行的外泌体分离方法，其操作流程如下：首先使用1000nm过滤器去除细胞外液中的大颗粒杂质（包括细胞碎片、完整细胞和凋亡体）；随后，滤液通过500-kD MWCO的过滤器进一步去除游离蛋白质及其他小分子杂质；最终，通过200nm过滤膜收集直径在50-200nm范围内的外泌体。
超滤技术凭借其高效率、低成本的设备需求、快捷的操作流程以及良好的便携性，在外泌体分离领域逐渐受到青睐。其分离得到的外泌体样本通常具有中等纯度，能够满足多种下游应用场景的需求。然而，超滤过程中的剪切应力可能导致样品的潜在劣化，同时存在因过滤膜堵塞或过度捕获而导致样品损失的风险。
尺寸排阻色谱法
尺寸排阻色谱法（SEC）是一种能够以最小结构损伤分离外泌体的技术。在过去的50年中，各种细小的多孔材料，如葡聚糖聚合物（Sephadex）、琼脂糖（Sepharose）和聚丙烯酰胺（Sephacryl或BioGel），已被广泛用于SEC的优化。早在外泌体被发现之前，SEC技术就已经得到了良好的发展，并被广泛应用于大分子及其聚集体（如蛋白质、聚合物和各种脂质体颗粒）的高分辨率分离。
基于尺寸排阻色谱的外泌体分离原理如下：当溶液通过由多孔树脂颗粒组成的固定相时，分子可以根据其尺寸进行分离。具体来说，流体动力学半径小于固定相孔隙的颗粒会进入孔隙，从而延长其通过路径；而较大的颗粒则无法进入孔隙，直接在树脂周围移动。这种机制导致不同尺寸的颗粒具有不同的保留时间，从而实现基于尺寸的分离。
SEC的一个显著优点是能够保存外泌体的天然生物活性。与超速离心和过滤等方法不同，SEC通过被动重力流进行操作，不会对囊泡结构和完整性造成影响。通过选择具有生理渗透压和粘度的洗脱缓冲液（例如PBS），可以进一步增强外泌体的自然状态。
除了维持外泌体的功能外，SEC还具有其他多项优势。首先，SEC所需的样本量较小，可以低至15μL；其次，该方法无需额外的预处理步骤；第三，操作时间可控，有助于节省人力和物力成本；第四，与超滤法类似，通过调整所用材料的孔径，可以分离出明确的细胞外囊泡亚群；第五，溶质与固定相之间不发生相互作用，从而确保样品损失最小化，提高产量。
SEC不仅适用于处理微量液体样本，而且易于扩展和自动化，适用于高通量外泌体制备。然而，其大规模商业化生产面临的挑战包括相对较高的设备成本以及对外泌体富集方法的额外需求。
聚合物诱导沉淀法
聚合物诱导沉淀法是一种常用的外泌体分离策略，其原理是利用高亲水性不含水的聚合物改变外泌体的溶解度。该方法类似于乙醇介导的核酸沉淀，其中高度亲水的聚合物与外泌体周围的水分子相互作用，形成疏水性微环境，从而导致外泌体沉淀。在各种亲水性聚合物中，聚乙二醇（PEG）是一种被广泛研究的无毒聚合物，常用于医药产品中，并具有改变周围材料水溶性的能力。目前，PEG已被广泛应用于外泌体分离，并且是多种流行商业外泌体分离试剂盒的基础。
现有的基于聚合物的外泌体沉淀方法通常采用分子量在6000至20000 Da之间的PEG。首先，需要进行预处理以去除大的污染物颗粒，例如细胞碎片和凋亡体。然后，将预处理后的样品与PEG溶液在4°C下孵育过夜。接下来，通过低速离心（1500g/10min）收集沉淀的外泌体。
聚合物沉淀法的优势在于操作简便、设备需求低、样本量兼容性高、分离效率高，并且能够去除蛋白质聚集体和其他细胞外囊泡污染物。然而，该方法所需的处理时间较长，需要复杂的清理步骤，这可能会影响下游分析和定量的结果。
免疫亲和力捕获法
免疫亲和力捕获法能够分离出高度纯化的外泌体，并可用于原位检测。理论上，任何仅存在于外泌体膜上或在细胞外液中缺乏可溶性对应物的蛋白质或细胞膜组分都可以用于基于免疫亲和力的外泌体捕获。在过去的几十年中，研究人员已经鉴定了多种外泌体标志物，包括溶酶体相关膜蛋白-2B、跨膜蛋白、热休克蛋白、血小板衍生生长因子受体、融合蛋白、脂质相关蛋白以及磷脂酶等。其中，Rab5、CD81、CD63、CD9、CD82、膜联蛋白和Alix等跨膜蛋白已被广泛应用于商业化选择性外泌体分离。为了有效地分离基于免疫亲和力的外泌体，需要将抗体固定在固体表面上。目前，亚微米大小的磁性颗粒被广泛用于重组蛋白的免疫沉淀。
该方法不仅因其较大的表面积和均匀的工艺而实现较高的捕获效率和灵敏度，还能够容纳较大的起始样品量，从而允许针对特定应用进行规模调整。此外，据报道，该方法可以通过检测分离的外泌体上的疾病特异性标志物（例如用于癌细胞的EpCAM、CD133、EGFR等）直接转化为诊断平台，通过疾病特异性抗体和磁激活细胞分选技术实现。
然而，必须考虑到的是，与该方法相关的非中性pH和非生理洗脱缓冲液（用于将外泌体与抗体分离）可能会不可逆地影响所收集的外泌体的生物学功能。因此，在实际操作中，必须继续优化外泌体标志物的选择，并寻找对外泌体天然结构损伤更小的洗脱步骤。此外，该方法还存在产量较低、抗体成本较高的问题，化学抗体或许是下一步的改进方向。同时，对于需要多个标志物阳性的总外泌体群体来说，该方法无法实现同时分离。
微流体技术
集成的微流体技术能够在微观尺度上探索外泌体的物理化学和生化特征，有助于实现外泌体分离和分析的一体化。
在现有信号检测平台的推动下，这些小型化微流体装置不仅可以从微量体液（如指尖血样）中快速分离出外泌体，还可以进行实时外泌体表征以实现原位诊断。事实上，微流体技术通过将传统的两步程序（外泌体分离和表征）整合到一个集成步骤中，正在极大地改变基于外泌体的诊断格局。
微流体技术可以分为基于免疫亲和力的微流体分离技术、基于尺寸的微流体分离技术以及非接触式微流体技术。基于免疫亲和力的微流体技术目前能够实现高效和高特异性的外泌体分离，而基于尺寸的微流体分离技术则能够提高分离纯度。未来的非接触式微流体技术或许将成为外泌体制备的多功能工具，并有助于实现外泌体的实时分析。
非接触式微流体技术可简化外泌体分离过程。在基于粘弹性介质流动的微流体系统中，含外泌体的流体与鞘流从不同入口添加后相遇，并首先沿着微通道壁对齐。在施加由流体的粘弹性引起的弹性提升力后，外泌体和其他细胞外组分根据其大小被驱动向微通道的中心线，较大的颗粒最终到达中心线。在超声波的作用下，具有不同机械性能（例如可压缩性、大小和密度）的颗粒经历差分辐射力，从而实现无接触且尺寸依赖性的外泌体分离。
| 名称 | 货号 | 规格 |
| 外泌体纯化试剂盒(SEC) | abs9777-1mL | 1mL |
| 外泌体纯化柱 | abs50185-20T | 20T |
| 外泌体RNA提取试剂盒 | abs60263-50T | 50T |
