外泌体保存
外泌体不同的功能
外泌体（Exosomes）作为细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）的重要亚群，直径范围30-150nm，呈现典型的双层脂质膜结构与茶托状形态特征。其 cargo 包含核酸、蛋白质及脂质等生物大分子复合物，在细胞间通讯网络中发挥关键介质作用。此类囊泡广泛分布于细胞培养上清液及多种生物体液中，包括但不限于血液、淋巴液、唾液、尿液、精液及乳汁等，同时在脑组织、肌肉组织、脂肪组织等实体组织中亦有检出。
外泌体的高效分离纯化与结构完整性保持，是深入解析其体内生物学功能及作用机制的核心前提，同时构成限制基于外泌体的临床诊断技术与治疗载体开发的关键技术瓶颈。尽管所有细胞均具备外泌体分泌能力，但不同细胞来源的外泌体在分泌效能及 cargo 组成上呈现显著异质性，这种差异性直接决定了其功能特异性与生物学效应的多样性。
外泌体通过介导细胞间物质转运与信号传导，深度参与细胞生理活动的调控过程。其功能谱系涵盖抗原提呈、免疫调节、细胞表型转化诱导以及肿瘤发生发展促进等生物学过程。特别值得注意的是，外泌体凭借其天然纳米载体特性，在药物递送系统开发中展现出独特应用潜力。
外泌体提取纯化技术
外泌体作为细胞外囊泡的重要组成，可由体内外多种细胞类型分泌，并广泛分布于血浆、胆汁、尿液、母乳、唾液、胸腔积液、淋巴液、胃酸、支气管肺泡灌洗液、脑脊液、眼泪、精液、滑膜液、羊水、腹水、鼻分泌物及子宫抽吸物等生物体液中。基于差异化的分离原理，当前已开发出五类主流外泌体纯化技术：基于质量密度的超速离心法、基于粒径差异的分离技术、基于溶解特性的聚合物沉淀法、基于免疫识别原理的亲和层析法，以及基于流体动力学特性的微流控分离技术。
从生物体液中分离高纯度外泌体是开展后续功能研究的关键步骤。差速超速离心法作为目前公认的“金标准”技术，通过结合0.22 μm或0.45 μm微孔滤膜进行超滤处理，可有效提升产物纯度并减少外泌体聚集现象。然而，该方法的分离效能受加速度、转子类型、旋转半径、沉降距离及样品黏度等多参数影响，需严格优化实验条件。
密度梯度离心法作为差速超速离心的改良技术，通过预先构建密度梯度介质层（如蔗糖、碘克沙醇或氯化铯溶液），实现外泌体的精准分离。根据梯度构建方式及分离机制的不同，可进一步细分为速率区带离心法与等密度梯度离心法。前者依赖颗粒沉降速率的差异进行分离，要求精确控制离心时间；后者则通过密度匹配原理，使不同密度组分富集于对应密度梯度区带，实现高纯度分离。
外泌体的保存
外泌体作为具有双层脂质膜结构的细胞外囊泡，其天然的双层脂膜结构赋予其良好的生物稳定性，可有效阻隔体液中各类酶解作用，从而维持内部生物分子的结构完整性与生物学活性。然而，分离纯化后的外泌体其物理化学特性及功能活性仍易受保存介质、温度条件及储存时长等多重因素影响。
常规外泌体制剂多悬浮于磷酸盐缓冲液体系。当前主流保存策略以低温冷冻贮藏为主，但该技术路径存在潜在风险：反复冻融操作可能导致外泌体膜结构完整性破坏、囊泡聚集现象加剧，并引发表面蛋白分子构象改变、生物标志物组分变异等不利影响。值得注意的是，血清细胞外囊泡DNA在多种保存条件下均表现出良好的稳定性，而血浆RNA在4°C短期保存及-20°C长期保存条件下均发生显著降解，仅miRNA展现出优异的稳定性，这为其作为疾病标志物的临床转化提供了理论依据。
外泌体亚群间的异质性导致其保存特性呈现显著差异。精液外泌体经-80°C冷冻保存30年后仍能维持原始形貌特征、理化性质及核酸蛋白组分稳定性；而支气管肺泡灌洗液来源的外泌体在相同条件下则出现囊泡体积增大、半数以上蛋白质丰度改变等劣化现象。当前实验室常规采用三级温度管理体系：-80°C深低温冻存适用于长期保存，4°C短期保存可避免冻融损伤但需承担生物分子降解风险，-20°C条件则因可能诱发不可逆相变而较少采用。
针对特殊应用场景开发的冻干保存技术，通过引入海藻糖等相容性保护剂，可有效抑制冷冻过程中冰晶形成、维持膜结构稳定性、减少囊泡聚集现象。功能验证研究表明，不同保存条件对外泌体粒径分布、颗粒浓度、细胞摄取效率及体内生物分布特性均产生显著影响。因此，建议根据具体研究目标制定个性化保存方案：基础研究领域推荐采用4°C或-20°C短期保存以保证实验可重复性，而治疗制剂开发则需严格采用-80°C深低温冻存工艺以确保临床应用安全性。
外泌体鉴定
外泌体分离后需通过多维度鉴定策略确认其身份特征，鉴定体系涵盖物理特性表征与分子标志物检测两大核心模块。主要技术手段包括：
透射电子显微镜分析法（TEM）：作为外泌体形态学鉴定的权威技术，可清晰呈现其特征性双层囊膜结构及典型茶托状或一侧凹陷的半球形构象。
纳米颗粒跟踪分析技术（NTA）：该技术可在维持外泌体天然状态条件下实现快速检测，同步获取粒径分布曲线与颗粒浓度定量数据，为外泌体物理特性分析提供关键参数。
免疫印迹分子标志物检测：通过特异性抗体识别外泌体膜蛋白与胞质蛋白标志物，包括四跨膜蛋白家族（CD9、CD63、CD81）、细胞骨架蛋白（肌动蛋白）、钙磷脂结合蛋白家族（膜联蛋白）、内体分选复合体相关蛋白（ALIX、TSG101）、热休克蛋白家族（HSP70/90）及组织特异性蛋白标志物。国际细胞外囊泡学会推荐采用双重阳性标志物与单一阴性标志物联合检测策略。
亲脂性荧光染料标记技术：PKH67/PKH26等染料因能与外泌体脂质双层膜形成稳定共价结合，已成为体内外示踪研究的主流标记工具，广泛应用于外泌体生物学行为追踪研究。
外泌体研究技术指南
样本处理规范
- 适用样本类型：适用于细胞培养上清液、血清、血浆、尿液及低密度体液（脑脊液、腹水、羊水、乳汁、唾液等）的外泌体分离。
- 低温保存规范：血样/体液样本可经离心去除细胞成分后分装冻存于-20°C或-80°C，推荐新鲜样本即时处理，长期保存应选用-80°C深低温冻存。
- 冻融管理策略：建议采用硅化离心管分装保存以减少粘附损失，避免反复冻融操作。功能性实验推荐使用4°C短期保存样本（保存期限≤7天），长期储存应选用-80°C深低温条件。
- 抗凝剂选择原则：血液样本采集应避免使用肝素抗凝管（干扰RNA实验），优先选用EDTA抗凝管，必要时在PCR反应体系中优化Mg²⁺浓度。
外泌体分离优化
5. 粘稠样本处理：对高粘度样本建议采用1×PBS缓冲液进行等体积稀释预处理。
6. 血清外泌体去除：可通过100,000×g超速离心10小时或改用无血清培养基培养消除血清来源外泌体污染。
7. 无外泌体培养体系：细胞预培养至60%-70%融合度时更换为无外泌体血清培养基或无血清培养基，继续培养24-48小时后收取上清。
8. 细胞活性控制：收获细胞时死细胞比例应控制在5%以下，凋亡细胞释放的囊泡会污染外泌体制剂。
质量控制标准
9. 鉴定指标体系：需通过透射电镜形态学分析、粒径分布检测、Western blot标志蛋白检测（含双重阳性标志物与单一阴性标志物）进行综合鉴定。
10. 测序样本准备：小RNA测序建议使用40mL以上细胞培养上清（低丰度样本需经10kD超滤柱浓缩），目标RNA总量应达到20ng以上。
11. 定量PCR内参选择：可根据样本类型选用外源 spike-in 对照（cel-miR-39-3p）或内源性对照（U6、SNORD61/68/72）。
12. 蛋白提取规范：Western blot检测前需按1:1体积比加入RIPA裂解液进行样本制备，该检测为定性分析无需内参校正。
特殊样本处理
13. 组织外泌体提取：无菌条件下将组织机械剪切至微米级碎片，经12小时无血清培养后，通过3000×g离心20分钟去除细胞残骸，依次经0.45μm与0.22μm滤器过滤后进行超速离心分离，推荐采用Transwell培养系统优化提取效率。
| 名称 | 货号 | 规格 |
| 外泌体纯化试剂盒(SEC) | abs9777-1mL | 1mL |
| 外泌体纯化柱 | abs50185-20T | 20T |
| 外泌体保存液（2×） | abs9776-50ml | 50ml |
