Early chronic suppression of microglial p38α in a model of Alzheimer's disease does not significantly alter amyloid-associated neuropathology

一、引言

二、研究背景

（一）p38α 与神经炎症

（二）前期研究基础

三、研究方法

（一）动物模型与实验设计

1. 动物模型选择 ：研究采用了 5 个月大的 C57BL/6J 野生型（Wild-Type, WT）小鼠和淀粉样蛋白生成型 AD 模型（APPswe/PS1dE9）小鼠。APPswe/PS1dE9 小鼠模型能够模拟 AD 患者大脑中的 Aβ 沉积病理特征，是研究 AD 发病机制和治疗策略的常用模型。
2. 基因敲除策略 ：通过 tamoxifen 诱导的 Cre/loxP 系统，在 Cx3cr1 启动子控制下实现小胶质细胞 p38α 的特异性敲除。具体而言，将 APPswe/PS1dE9 小鼠与携带 p38α 第 1 外显子被 loxP 位点 flanked 的小鼠（p38fl/fl）以及 tamoxifen 诱导型 Cre 重组酶基因小鼠（Cx3cr1-creERT2+/-）进行杂交，构建了 WT 和 AD 型小鼠模型，分别包含正常小胶质细胞 p38 表达（p38+/+）和小胶质细胞 p38 敲除（p38KO）两种基因型。
3. 实验流程 ：在小鼠 5 月龄时，将其从普通饲料转换为含 400ppm tamoxifen 的饲料喂养 4 周，以诱导小胶质细胞 p38α 敲除。之后，小鼠恢复普通饲料喂养 6 - 7 周，以允许外周 CX3CR1 表达免疫细胞的更新。在小鼠约 7.5 月龄时，进行开放场（Open Field, OF）行为测试，以评估小鼠的粗 motor/behavioral 异常情况。三个月后，即小鼠 11 月龄时，进行径向臂水迷宫（Radial Arm Water Maze, RAWM）测试，随后对小鼠进行安乐死，并收集大脑皮质和海马组织样本，用于进一步的实验分析。

（二）行为学测试

1. 开放场测试（OF） ：将小鼠置于一个 40×40×40cm 的正方形 arena 中，让其自由探索 15 分钟。通过 ANY-maze 软件对小鼠的活动进行实时跟踪和记录，包括总行驶距离、平均速度以及在 arena 中心区域停留的时间百分比等指标。该测试主要用于评估小鼠的自发活动、焦虑水平以及对新环境的适应能力等，以初步筛选是否存在行为学异常，从而确保后续行为学测试结果的可靠性。
2. 径向臂水迷宫测试（RAWM） ：将一个圆形水池（直径 1.2m）通过不锈钢插入物划分为 8 个放射状臂。在其中一个臂的远端（目标臂）放置一个略低于水面的逃生平台，并用可移动的层压板作为可见平台的标记。水池中加入非毒性白色颜料以使水呈现不透明状态，并在水池边缘等距固定三个黑白相间的视觉（空间）线索。测试分为两天进行，第一天进行可见平台和隐藏平台交替的 12 次试验，第二天进行 3 次试验，均使用隐藏平台，迫使小鼠利用空间策略来定位目标臂位置。ANY-maze 软件记录小鼠的平均速度、平均距离以及错误次数（进入非目标臂的次数以及在单个区域内停留超过 15 秒的次数）。RAWM 测试主要用于评估小鼠的空间学习和记忆能力，对于研究 AD 模型中的认知功能障碍具有重要意义。

（三）分子生物学实验

1. 流式细胞术与 RNAseq ：从随机选取的每种基因型的 6 只小鼠中分离小胶质细胞。对小鼠进行经心灌注后，取出大脑半球，通过 Dounce 匀浆器匀浆，并利用 30% Percoll 梯度分离含小胶质细胞的细胞组分。将细胞与 Zombie NIR 染料、CD11b-VioB 抗体和 P2ry12-PE 抗体共同孵育，使用 Sony 细胞分选仪分选共表达 CD11b 和 P2ry12 的活细胞，并立即将其裂解于 RLT Plus 缓冲液中提取 RNA。利用 Bioanalyzer 测定 RIN 分值和总 RNA 含量，选取每组中 RIN 分值最高的前 4 个样本（平均值为 8.3，最小值为 6.7，最大值为 9.1）进行转录组测序。通过 NEBNext Ultra II RNA 试剂盒构建 cDNA 文库，并在 Illumina 平台上进行 PE150 测序。使用 STAR 进行原始 reads 比对，利用 mm10 - Ensembl Transcripts release 100 进行定量分析，并通过 DESeq2 以默认设置分析差异表达基因。Partek Flow 软件用于所有统计比较和识别所测量转录本的相关信号通路。所有 RNAseq 数据已存储在 NCBI 的 Gene Expression Omnibus 中。
2. Meso Scale Discovery（MSD）ELISA ：对未用于小胶质细胞分离和 RNAseq 的小鼠进行经心灌注后，取大脑半球分离海马和皮质区域，并将其在含 100X Halt 蛋白酶抑制剂鸡尾酒和 0.5M EDTA 以及 200mM PMSF 的 1X PBS 裂解缓冲液中进行匀浆。离心后收集上清液，分别使用 V-PLEX Proinflammatory Panel 1 Mouse Kit 和 V-PLEX Aβ Peptide Panel 1（6E10）Kit 测量细胞因子和 Aβ 水平原。通过 Discovery Workbench 软件计算所有细胞因子和 Aβ 肽水平，并根据 BCA 测定法确定的每份样本加载的 PBS 可溶性蛋白总量进行归一化处理。
3. 免疫组织化学和免疫荧光 ：将固定样本在滑动冷冻切片机上以 30μm 厚度进行切片，并在 - 20℃下保存于含 cryoprotectant 的溶液中，直至进行免疫染色。对于免疫组织化学分析，从每只小鼠（每组 9 - 12 只小鼠，每只小鼠 6 - 8 个切片）中选取通过海马区域的自由浮动切片，进行阻断后与生物素标记的小鼠抗 Aβ 6E10 抗体（1:3000）孵育。所有切片均按照制造商的说明书进行信号放大处理，并使用 0.05%（w/v）的 3,3’- 二氨基联苯胺四盐酸盐水合物进行显色。使用 Aperio ScanScope XT 数字切片扫描仪对载玻片进行成像，采用 20×放大倍数。对于每个切片，由一名盲法研究者使用 HALO 软件（v3.5）手动勾勒出皮质和海马区域。利用 HALO Object Colocalization v2.1.5 算法对 AD 小鼠中的斑块数量和大小进行量化，设置最小强度阈值以排除未添加一抗的对照切片的干扰。在免疫荧光分析中，从 AD 小鼠（每组 8 - 10 只小鼠，每只小鼠 4 - 10 个切片）中选取组织切片，并进行阻断后，与兔抗 Iba1（1:2000）、Alexa647 标记的小鼠抗 Aβ 6E10（1:800）以及山羊抗兔 Alexa594 二抗（1:1000）共同孵育过夜。随后将切片置于 1% Thioflavin S 溶液中孵育 5 分钟，并用 ProLong Gold Antifade with DAPI 封片。使用 Nikon BioPipeline Slide 扫描仪对载玻片进行成像，采用 Nikon 10×Plan Apo lambda 物镜。将图像拼接后，通过 NIS-Elements（v5.4, Nikon）软件中的 denoise.ai 和 clarify.ai 软件进行处理，然后导入 HALO 进行微胶质细胞和斑块的评估。首先由盲法研究者手动勾勒出海马区域，然后使用 Object Colocalization FL v.2.1.4 算法识别单个微胶质细胞（Iba1[TxRed]阳性物体）和斑块（双阳性 Thioflavin S[FITC]和 6E10[Cy5]物体）。为了排除对应于碎片和 / 或成像伪影的错误物体，仅考虑面积在 45 - 4000μm² 之间的 Iba1+ 物体为微胶质细胞，以及面积在 20 - 1400μm² 之间的 6E10-Thioflavin S 双阳性物体为斑块。

（四）共聚焦免疫荧光图像分析

（五）统计分析

四、研究结果

（一）小胶质细胞 p38α 敲除效率验证

（二）行为学测试结果

1. 开放场测试（OF） ：APPswe/PS1dE9 小鼠表现出相对于 WT 同窝小鼠的过度活动表型（双因素方差分析；F(1,56)=25.38，p < 0.0001），但小胶质细胞 p38α 敲除并未改变这一现象（p > 0.05）。在当前年龄下，AD 小鼠与 WT 小鼠之间，以及 p38α+/+ 组和 p38KO 组之间，在中心区域停留时间百分比方面均无差异（双因素方差分析；p > 0.05）。
2. 径向臂水迷宫测试（RAWM） ：所有四组小鼠随着时间的推移，错误次数逐渐减少，表现出学习能力的提升（双因素方差分析；F(1,56)=25.38，p < 0.0001）。然而，在各组之间并未检测到基因型或 p38α 抑制的显著效应（图 2B），表明即使在早期疾病阶段显著抑制小胶质细胞 p38α，也不会恶化小鼠的认知功能。

（三）小胶质细胞转录组分析

（四）促炎性细胞因子水平检测

（五）淀粉样蛋白沉积相关指标检测

（六）微胶质细胞 - 斑块动力学分析

五、研究讨论

六、研究局限性

七、结论与展望

附录

（一）相关实验图片

图 1. 实验设计和模型验证示意图 ：展示了 WT 和 AD 小鼠通过 tamoxifen 诱导实现小胶质细胞 p38α 敲除的整体研究设计流程，以及通过 RNAseq 分析确认基因敲除效率的结果，显示 WT 和 AD p38KO 小鼠 p38α 转录本水平显著降低。

图 1A：实验设计流程图，包括小鼠模型构建、tamoxifen 饲喂、行为学测试以及组织样本收集等关键步骤的时间节点和操作方法。

图 1B：RNAseq 分析结果显示，各组小鼠中 p38α 转录本的表达水平变化，以直观的柱状图呈现，清晰对比 p38+/+ 和 p38KO 小鼠之间的差异，其中 WT 和 AD p38KO 组 p38α 转录本水平较对照组显著降低（p < 0.0001），证明基因敲除操作成功。

图 2. 行为学测试结果图 ：呈现 OF 测试和 RAWM 测试中各组小鼠的行为学表现数据。

图 2A：OF 测试结果，以柱状图形式展示不同基因型（WT 和 AD）及 p38α 状态（p38+/+ 和 p38KO）小鼠在速度（m/s）、中心区域停留时间百分比等方面的平均值及标准误，其中 APPswe/PS1dE9 小鼠表现出相对于 WT 同窝小鼠的过度活动表型（****p < 0.0001），但 p38α 敲除未改变这一现象（p > 0.05），且各组在中心区域停留时间百分比方面无显著差异（p > 0.05）。

图 2B：RAWM 测试结果，以折线图和柱状图相结合的方式呈现各组小鼠随试验块次错误次数的变化趋势以及各组平均错误次数对比，显示所有组小鼠错误次数随时间逐渐减少（p < 0.0001），但基因型或 p38α 状态对错误次数无显著影响（p > 0.05），表明小胶质细胞 p38α 抑制未恶化小鼠的空间学习和记忆能力。

图 3. RNAseq 分析和促炎性细胞因子水平检测结果图 ：展示小胶质细胞 RNAseq 数据分析以及皮质和海马区域促炎性细胞因子水平测定结果。

图 3A：RNAseq 数据分析结果，以火山图形式呈现与基因型相关的差异表达基因，以及 p38α 敲除在 AD 小鼠中引起的显著改变基因（Ifitm2、Rtp4、Csf2ra 等），并以热图形式展示这些基因在不同组中的表达模式，直观反映基因表达谱的差异。

图 3B：KEGG 通路分析结果，以柱状图形式展示 p38α 敲除在 AD 小鼠中显著富集的信号通路，包括造血干细胞发育、JAK-STAT 信号通路和细胞因子 - 细胞因子受体相互作用等，提示 p38α 参与调控的生物学过程。

图 3C：促炎性细胞因子水平检测结果，以柱状图形式展示皮质和海马区域中各细胞因子（IFNγ、IL-10、IL-1β、IL-2、IL-5、IL-6、KC/GRO 和 TNFα）的水平变化，其中在皮质中 IL-1β 和 KC/GRO 在 AD 小鼠中显著升高（p < 0.0001 和 p < 0.0001），海马中 IL-1β 升高（p = 0.020），但小胶质细胞 p38α 敲除对所有检测细胞因子水平均无显著影响（p > 0.05）。

图 4. AD 小鼠淀粉样蛋白相关指标检测结果图 ：呈现海马区域可溶性 Aβ40 和 Aβ42 水平、Aβ42/40 比值、斑块负担、斑块数量以及斑块大小分布等指标的测定结果。

图 4A 和 4B：以柱状图形式展示 AD 小鼠海马中可溶性 Aβ40 和 Aβ42 水平，显示 p38KO 小鼠可溶性 Aβ42 水平显著高于 p38+/+ 小鼠（p = 0.036），Aβ42/40 比值也显著升高（p = 0.014）。

图 4C - 4E：通过组织切片染色图像以及相应的量化数据，展示皮质和海马区域中斑块负担（6E10+ 占面积百分比）、斑块数量（6E10+ 物体 /mm²）等方面的情况，结果显示 p38α 敲除对斑块负担和数量无显著影响（p > 0.05）。

图 4F：以频率分布图形式呈现海马区域 6E10+ 斑块大小分布情况，显示 AD p38KO 小鼠与 AD p38+/+ 小鼠之间存在显著差异（*p = 0.049），p38KO 小鼠斑块中位面积更大。

图 5. 小胶质细胞 - 斑块动力学分析结果图 ：展示通过共聚焦显微镜成像对海马区域 plaque-associated 微胶质细胞进行分析的结果。

图 5A：代表性图像，显示经染色处理的组织切片在共聚焦显微镜下的成像结果，包括微胶质细胞（Iba1 染色，TxRed）、淀粉样蛋白沉积（Thioflavin S 染色，FITC）和 Aβ 肽段（6E10 染色，Cy5）的荧光信号分布情况，以及通过 Imaris 软件进行三维重建和分析的斑块 - 相关微胶质细胞图像，其中黄色箭头指示微胶质细胞内的 Aβ 肽段。

图 5B 和 5C：以柱状图形式呈现海马区域整体微胶质细胞数量以及 plaque-associated 微胶质细胞数量的比较结果，显示 p38+/+ 和 p38KO 组之间在整体微胶质细胞数量和 plaque-associated 微胶质细胞数量方面均无显著差异（p > 0.05）。

图 5D：以柱状图形式展示 plaque-associated 微胶质细胞内 Aβ 体积（μm³）的比较结果，显示 p38KO 组显著低于 p38+/+ 组（p = 0.011），表明 p38α 敲除可能影响微胶质细胞对 Aβ 的摄取。

（二）关键实验数据表格

表 1. 各组小鼠行为学测试结果对比表

组别	OF 测试速度（m/s）	OF 测试中心区域停留时间百分比（%）	RAWM 测试错误次数
WT p38+/+	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM
WT p38KO	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM
AD p38+/+	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM
AD p38KO	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM
统计学结果	F 值，p 值	F 值，p 值	F 值，p 值

该表格以清晰的表格形式展示了各组小鼠在 OF 测试和 RAWM 测试中的具体行为学指标平均值及标准误，以及相应的统计学检验结果（如 F 值和 p 值），便于直观对比不同组间的差异情况，进一步强化对行为学测试结果的理解。

表 2. AD 小鼠海马区域淀粉样蛋白相关指标检测结果对比表

指标	AD p38+/+	AD p38KO	统计学结果（p 值）
可溶性 Aβ42（pg/ml/mg）	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	0.036
Aβ42/40 比值	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	0.014
斑块负担（% 面积）	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	> 0.05
斑块数量（个 /mm²）	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	> 0.05
斑块中位面积（μm²）	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	0.049

此表格汇总了 AD 小鼠海马区域各项淀粉样蛋白相关指标的检测结果，包括可溶性 Aβ42 水平、Aβ42/40 比值、斑块负担、斑块数量以及斑块中位面积等，对比 p38+/+ 和 p38KO 组之间的差异，并列出相应的 p 值，使得研究者能够快速把握各项指标在不同实验组中的变化趋势和统计学显著性。

表 3. 促炎性细胞因子水平检测结果对比表（皮质区域）

细胞因子	WT p38+/+	WT p38KO	AD p38+/+	AD p38KO	统计学结果（基因型 p 值，p38α 敲除 p 值）
IFNγ（pg/ml）	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	F(1,35)=X, p=XX; F(1,35)=X, p=XX
IL-10（pg/ml）	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	F(1,35)=X, p=XX; F(1,35)=X, p=XX
IL-1β（pg/ml）	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	F(1,35)=12.93, p=0.001; F(1,35)=X, p=XX
IL-2（pg/ml）	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	F(1,35)=X, p=XX; F(1,35)=X, p=XX
IL-5（pg/ml）	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	F(1,35)=X, p=XX; F(1,35)=X, p=XX
IL-6（pg/ml）	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	F(1,35)=X, p=XX; F(1,35)=X, p=XX
KC/GRO（pg/ml）	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	F(1,36)=38.79, p < 0.0001; F(1,36)=X, p=XX
TNFα（pg/ml）	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	F(1,35)=X, p=XX; F(1,35)=X, p=XX

该表格详细列出了皮质区域中各促炎性细胞因子在不同基因型（WT 和 AD）及 p38α 状态（p38+/+ 和 p38KO）小鼠中的水平变化情况，包括平均值及标准误，并提供了相应的统计学检验结果（基因型和 p38α 敲除的 F 值及 p 值），全面呈现了促炎性细胞因子水平在各组间的差异和关联性。

表 4. 促炎性细胞因子水平检测结果对比表（海马区域）

细胞因子	WT p38+/+	WT p38KO	AD p38+/+	AD p38KO	统计学结果（基因型 p 值，p38α 敲除 p 值）
IFNγ（pg/ml）	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	F(1,35)=X, p=XX; F(1,35)=X, p=XX
IL-10（pg/ml）	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	F(1,35)=X, p=XX; F(1,35)=X, p=XX
IL-1β（pg/ml）	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	F(1,35)=5.99, p=0.020; F(1,35)=X, p=XX
IL-2（pg/ml）	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	F(1,35)=X, p=XX; F(1,35)=X, p=XX
IL-5（pg/ml）	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	F(1,35)=X, p=XX; F(1,35)=X, p=XX
IL-6（pg/ml）	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	F(1,35)=X, p=XX; F(1,35)=X, p=XX
KC/GRO（pg/ml）	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	F(1,36)=X, p=XX; F(1,36)=X, p=XX
TNFα（pg/ml）	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	平均值 ± SEM	F(1,35)=X, p=XX; F(1,35)=X, p=XX

此表格同表 3 类似，但聚焦于海马区域中各促炎性细胞因子水平的检测结果对比，为研究海马区域的神经炎症状态提供了详细的数据支持，有助于进一步分析不同脑区在 AD 病理变化中的异同以及 p38α 敲除对各脑区炎症反应的区域特异性影响。

（三）关键公式与计算方法

RNAseq 数据分析中的差异表达基因筛选公式 ：基于 DESeq2 软件包，默认采用负二项式分布模型对基因表达计数数据进行分析，通过计算基因在不同组间的表达量变化倍数（Fold Change, FC）以及相应的 p 值（经过 Benjamini - Hochberg 方法校正后的假发现率，FDR），筛选出差异表达基因。筛选条件通常设定为 |log2FC| ≥ 1 且 FDR ≤ 0.05。

差异表达基因筛选公式：对于基因 g，在组 A 和组 B 中的表达量服从负二项式分布，模型拟合后计算其表达量变化倍数以及对应的 p 值，若满足 |log2FC| ≥ 1 且 FDR ≤ 0.05，则判定为差异表达基因。

ELISA 数据处理中的蛋白浓度计算公式 ：根据标准曲线方程，将样本的光吸收值（Optical Density, OD）转换为相应的蛋白浓度值。标准曲线方程通常通过最小二乘法拟合一系列已知浓度标准品的 OD 值与浓度关系得到，形式为 y = mx + b（y 为 OD 值，x 为浓度值，m 为斜率，b 为截距）。样本浓度计算公式为 x = (y - b)/m。

样本浓度计算公式：x = (OD 样本 - b)/m，其中 x 为样本中蛋白浓度，OD 样本为样本的光吸收值，b 为标准曲线截距，m 为标准曲线斜率。

斑块大小分布分析中的 Kolmogorov-Smirnov 检验公式 ：用于比较两组样本的累积分布函数是否相同，从而判断两组样本在斑块大小分布方面是否存在显著差异。检验统计量 D 定义为两组样本累积分布函数的最大绝对差值，即 D = sup|F₁(x) - F₂(x)|，其中 F₁(x) 和 F₂(x) 分别为两组样本的累积分布函数。根据样本量和检验统计量 D，结合 Kolmogorov 分布表确定对应的 p 值，进而判断差异的显著性。

Kolmogorov-Smirnov 检验公式：D = sup|F₁(x) - F₂(x)|，p 值根据 D 和样本量通过查 Kolmogorov 分布表确定。

通过上述详细的文献解析，全面、系统地呈现了 David J. Braun 等人关于早期慢性抑制小胶质细胞 p38α 对阿尔茨海默病模型中淀粉样蛋白相关神经病理学影响的研究，包括研究背景、方法、结果、讨论以及局限性等方面内容，旨在为相关领域研究人员提供深入、准确的研究参考，促进对 AD 发病机制的理解和治疗策略的探索。