RT-PCR 常见问题剖析与解决方案

一、RT-PCR 灵敏度问题

（一）RNA 被降解

• 问题分析 ：RNA 分子较为脆弱，易受 RNase 等因素影响而发生降解，导致可参与逆转录的有效 RNA 模板数量减少，最终影响 RT-PCR 产物的生成。
• 解决方案 ：
  • 在对 RNA 完整性进行验证之前，优先采用变性胶电泳分析 RNA 样品，以便准确评估其完整性。
  • 运用严谨的无污染技术分离 RNA，严格遵守实验操作规范，避免 RNase 污染。
  • 在将组织从动物体取出后，应立即进行处理，减少 RNA 降解的可能性。

（二）RNA 中包含逆转录抑制剂

• 问题分析 ：RNA 样品中若存在逆转录抑制剂，会干扰逆转录酶的活性，抑制 cDNA 合成过程，进而导致 RT-PCR 产物量减少。
• 解决方案 ：
  • 可通过乙醇沉淀 RNA 的方式去除抑制剂，利用 70%（体积分数）乙醇对 RNA 沉淀进行清洗，有助于进一步纯化 RNA 样品。在操作过程中，可加入糖元（浓度为 0.25μg/μL 至 0.4μg/μL），以协助小量样品 RNA 的回收。
  • 常见的逆转录抑制剂包括 SDS、EDTA、甘油、焦磷酸钠、亚精胺、甲酰胺和胍盐等。为检验 RNA 样品中是否存在抑制剂，可将对照 RNA 与待测样品 RNA 混合，分别进行逆转录反应，并对比两者的产物产量。

（三）用于合成 cDNA 第一链合成的引物未良好退火

• 问题分析 ：引物未能与 RNA 模板良好退火，会导致逆转录反应无法高效启动，影响 cDNA 合成效率，最终使 RT-PCR 产物量下降。
• 解决方案 ：
  • 确定引物退火温度是否与所使用的引物相匹配。对于采用随机六聚体作为引物的情况，建议在反应温度保温之前，先在 25℃条件下保温 10 分钟，以促进引物与 RNA 模板的结合。
  • 若使用基因特异性引物（GSP），可尝试更换其他 GSP，或者换用 oligo（dT）或随机六聚体引物，以确定 GSP 是否为反义序列，从而优化引物与 RNA 模板的退火效果。

（四）起始 RNA 量不足

• 问题分析 ：起始 RNA 量过少，直接限制了逆转录反应中可生成的 cDNA 模板数量，进而影响后续 PCR 扩增过程中的产物生成量。
• 解决方案 ：适当增加 RNA 起始量，以保证有足够的 RNA 模板参与逆转录反应，为后续 PCR 扩增提供充足的 cDNA 模板。

（五）RNA 模板二级结构过多

• 问题分析 ：RNA 模板中存在的复杂二级结构，可能会阻碍引物与 RNA 模板的结合，以及逆转录酶沿 RNA 模板的移动，从而影响 cDNA 合成效率。
• 解决方案 ：
  • 在不含盐及缓冲液的条件下，将 RNA 和引物进行变性 / 退火处理，以破坏 RNA 的二级结构，促进引物与 RNA 模板的结合。
  • 适当提高逆转录反应温度，但需注意，当反应温度超过 60℃时，不建议使用 oligo（dT）引物。对于基因特异性引物（GSP），应选择在所设定的反应温度下能够有效退火的引物序列。若 RT-PCR 产物长度大于 1kb，建议将反应温度控制在≤65℃范围内。

二、RT-PCR 特异性问题

（一）富含 G + C 的模板

• 问题分析 ：对于 G + C 含量较高的模板（通常指 G + C 含量＞50%），在 PCR 扩增过程中，容易因 G + C 碱基对之间较强的氢键作用，导致 DNA 双链解链困难，影响引物与模板的特异性结合，进而产生非预期的扩增条带。
• 解决方案 ：可使用 PCRx Enhancer Solution，该溶液能够改善富含 G + C 模板的扩增效果，提高 PCR 扩增的特异性和效率。

（二）镁离子浓度不当

• 问题分析 ：镁离子在 PCR 反应中对 Taq 酶活性和引物 - 模板复合物的形成具有重要作用。镁离子浓度过低可能导致引物与模板结合不稳定，引物错配增加，从而产生非特异性扩增条带；而镁离子浓度过高则可能引发 Taq 酶的非特异性延伸，同样会影响扩增特异性。
• 解决方案 ：进行一系列反应，从 1mmol/L 至 3mmol/L，以 0.5mmol/L 为间隔调整镁离子浓度，通过实验确定针对每个特定模板和引物对的最佳镁离子浓度，以优化扩增特异性。

（三）引物和模板非特异性退火

• 问题分析 ：引物与模板之间发生非特异性退火，可能是由于引物设计不佳、退火温度设置不当等原因导致。非特异性退火会引发非预期的 DNA 合成，从而在琼脂糖凝胶分析中出现额外的条带。
• 解决方案 ：在第一链合成过程中，优先使用基因特异性引物（GSP），而非随机引物或 oligo（dT）。此外，可尝试选用允许在较高温度下进行 cDNA 合成的 GSP，以降低非特异性退火的发生概率。

（四）RNA 中沾染基因组 DNA

• 问题分析 ：若 RNA 样品中混有基因组 DNA，在 RT-PCR 过程中，基因组 DNA 可能会作为模板直接参与 PCR 扩增，产生与 RNA 模板无关的非预期扩增条带，干扰实验结果的准确性。
• 解决方案 ：使用扩增级 DNase Ⅰ对 RNA 进行处理，以去除可能存在的基因组 DNA 污染。同时，设置不含逆转录步骤的对照反应，以检测 RNA 样品中是否仍有基因组 DNA 残留。

三、PCR 忠实性问题

（一）聚合酶忠实性低

• 问题分析 ：某些 DNA 聚合酶缺乏 3' → 5' 校对外切酶活性，在 DNA 合成过程中容易出现碱基错配，导致 PCR 产物序列中引入错误，影响扩增产物的准确性。
• 解决方案 ：选用具有校正活性的热稳定聚合酶，这类聚合酶具备较高的忠实性，能够在 DNA 合成过程中及时纠正碱基错配，降低错误发生率，提高 PCR 产物的序列准确性。

（二）循环数过多

• 问题分析 ：过多的 PCR 循环次数可能导致 DNA 聚合酶的累积错误增加。随着循环数的增加，DNA 聚合酶活性可能逐渐下降，且引物错配和非特异性扩增产物的积累也会加剧，从而在产物序列中引入更多错误。
• 解决方案 ：合理降低 PCR 循环数，根据目标 DNA 片段的初始拷贝数和所需扩增产物量，优化循环次数，以减少累积错误的发生，提高 PCR 产物的质量和准确性。