载体选择

一、双载体系列（两种荧光素酶分别位于两个载体上）

1. pMIR-REPORT 载体 ：该载体为双荧光素酶报告基因检测提供了基础平台，能够与海肾荧光素酶载体共转染细胞，实现报告基因功能。
2. pGL3 系列载体 ：这一系列载体包含了多种类型，常见的有 pGL3-Promoter、pGL3-Enhancer、pGL3-Basic 以及 pGL3-Control。所有载体均含有萤火虫荧光素酶报告基因。其中，pGL3-Control 作为对照载体使用；pGL3-Basic 仅含有一个 Luc 基因，未配置启动子与增强子结构；pGL3-Promoter 载体含有 SV40 启动子，适用于增强子检测相关实验；pGL3-Enhancer 则含有增强子元件，可用于启动子检测研究。
3. pRL 系列载体 ：由 Promega 公司开发的海肾荧光素酶报告载体。该系列载体的主要差异体现在所携带的启动子种类上，包括 pRL-CMV、pRL-SV40 等不同选择。在实验操作中，将 F-Luc 载体与 pRL 系列载体共转染 293 细胞时，pRL 系列载体主要发挥内参作用，用于校正实验数据，减少细胞转染效率差异等外部因素对结果的影响。

二、单载体系列（两种荧光素酶位于同一个载体上）

1. pmirGLO 载体 ：pmirGLO 是普洛麦格（Promega）公司开发的一款商品化双荧光素酶报告载体。这款载体的设计初衷是用于定量分析 miRNA 活动。它将萤火虫荧光素酶基因（luc2）和海肾荧光素酶基因（hRluc-neo）构建于同一载体框架内。特别地，萤火虫荧光素酶基因的 3’ 端设有一个多重克隆区域（MCS 区域），该区域内包含多个酶切位点。通过酶切连接操作，研究人员可以将 miRNA 靶点序列或者感兴趣基因的 3’ 非编码区插入其中。这使得 pmirGLO 载体能够满足对目标基因转录稳定性和活性的研究需求，为深入探究基因表达调控机制提供有力工具。
2. psiCHECK 系列载体 ：psiCHECK™-2 载体专注于为 RNA 干扰（RNAi）的优化提供一种定量且快速的检测方法。该载体的设计巧妙地将报告基因与目标基因融合，从而能够监测靶基因表达的变化情况。在 psiCHECK 载体系列中，海肾荧光素酶担任一级报告基因的角色。目标基因可以克隆到海肾荧光素酶翻译终止密码子下游的多个克隆区域。当启动对感兴趣基因的 RNAi 过程时，会导致融合 mRNA 的裂解并随后被降解。通过测量海肾荧光素酶活性的降低程度，可以方便地评估 RNAi 效应，为 RNA 干扰研究提供直观、有效的检测手段。

应用范围

1. 验证 mRNA/lncRNA/circRNA 与 miRNA 靶向互作 ：通过双荧光素酶报告基因检测系统，可将含有 mRNA/lncRNA/circRNA 预测的 miRNA 结合位点的片段克隆到萤火虫荧光素酶报告载体上，与 miRNA 共转染细胞后，若 miRNA 与该位点存在靶向互作，则会抑制萤火虫荧光素酶的表达，而海肾荧光素酶作为内参对照。通过检测两种荧光素酶的活性变化，从而确定它们之间的靶向关系。
2. 验证转录因子与启动子互相作用 ：将转录因子基因与表达载体连接构建重组质粒，同时将目的启动子区域克隆到萤火虫荧光素酶报告载体上，共转染细胞。若转录因子能与启动子结合并激活其活性，则萤火虫荧光素酶的表达量会增加；反之，若抑制启动子活性，则萤火虫荧光素酶表达量减少，进而验证转录因子与启动子之间是否存在相互作用以及其对启动子活性的影响。
3. 验证转录因子结合位点 ：在启动子区域存在多个潜在的转录因子结合位点，利用双荧光素酶报告基因检测系统对这些位点进行突变分析。将野生型和突变型启动子片段分别克隆到报告载体上，与转录因子表达载体共转染细胞，比较两种情况下荧光素酶的活性变化。如果突变后荧光素酶活性发生显著改变，则说明该位点是转录因子的功能性结合位点。
4. 启动子结构分析或启动子 SNP 分析 ：对启动子不同区域或含有 SNP（单核苷酸多态性）位点的片段进行克隆构建，插入到萤火虫荧光素酶报告载体中，转染细胞后检测荧光素酶活性。通过对比不同构建的荧光素酶活性，可以确定启动子的关键功能区域以及 SNP 位点对启动子活性的影响，深入了解启动子的结构与功能关系。
5. 诱导因素对启动子活性调节研究 ：将目的启动子克隆到萤火虫荧光素酶报告载体上，转染细胞后给予不同的诱导因素处理，如药物刺激、物理化学因子作用等。通过检测处理前后荧光素酶活性的变化，可评估诱导因素对启动子活性的调节作用，探究细胞信号转导通路对基因表达的调控机制。
6. 研究分析信号通路是否激活 ：将能够响应特定信号通路的启动子元件或报告基因构建到荧光素酶报告载体上，转染细胞后，若细胞内相应的信号通路被激活，则会相应地影响荧光素酶的表达。通过检测荧光素酶活性，可判断信号通路是否被激活以及其激活程度，为研究细胞信号转导和细胞生理功能提供重要依据。

优点

1. 易表达 ：荧光素酶在细胞内表达后无需经过复杂的后修饰过程，即可直接展现出可被检测的酶活性，这使得实验操作简便快捷，大大节省了实验时间和精力。
2. 高灵敏度 ：在所有的化学发光反应中，荧光素酶催化的化学反应所产生的光产物具有最高的量子效率，能够产生较强的荧光信号，即使在较低的表达水平下也能被准确检测到。此外，在宿主细胞及检测试剂中均检测不到背景发光，进一步提高了检测的灵敏度和准确性，使得微小的表达变化也能被清晰地捕捉到。
3. 低背景 ：哺乳动物细胞本身无内源性荧光素酶表达，这就避免了内源性荧光素酶对实验结果的干扰，为实验提供了一个相对纯净的检测环境，提高了数据的可靠性。
4. 高效，通量大 ：荧光素酶报告基因检测系统具有快速高效的检测特点，每个样品的检测时间仅需几秒钟，能够在较短的时间内完成大量的样品检测，特别适用于高通量的实验研究，提高了实验效率和数据产出量。
5. 优势检测条件 ：与绿色荧光蛋白（GFP）等荧光标记蛋白不同，荧光素酶的发光检测不需要激发光激发，这不仅避免了激发光对细胞的潜在损伤和荧光淬灭等问题，而且其发光信号的穿透力更强，能够更有效地从细胞和组织中检测到荧光信号，尤其适用于活细胞和厚组织样本的检测。