Decoding of miR-7-5p in Colony Forming Unit-Hill Colonies as a Biomarker of Subclinical Cardiovascular Disease-A MERIT Study
摘要： 本文详细解析了一篇关于 miR-7-5p 在集落形成单位 - Hill（CFU-Hill）集落中作为亚临床心血管疾病（CVD）生物标志物的研究文献。该研究首次在 1 型糖尿病（T1DM）患者中探讨了 miR-7-5p 的表达及其在二甲双胍干预下的变化，揭示了 miR-7-5p 在血管健康评估和心血管疾病早期检测中的潜在应用价值，为未来心血管疾病的精准医疗提供了新的视角和策略。
一、研究背景
心血管疾病（CVD）是全球死亡和医疗支出的首要原因，2021 年全球估计有 2050 万人死于 CVD，约占全球死亡人数的三分之一。其中，约 80% 的死亡归因于缺血性心脏病和脑血管病（中风）。1 型糖尿病（T1DM）是一种常见的代谢综合征，其特征是血糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱。长期高血糖常导致多种并发症，显著增加心血管疾病风险。研究表明，T1DM 患者的血管并发症可能涉及多种机制，包括核因子 κB（NFκB）的激活、氧化应激、动脉内皮细胞、血管平滑肌细胞和巨噬细胞等的异常。亚临床 CVD 可定义为血管内皮功能障碍，其在 T1DM 中已被证明先于动脉粥样硬化和冠状动脉疾病的发作。CFU-Hill 集落是一种敏感的血管健康生物标志物，通过释放趋化因子、促炎细胞因子和生长因子（如白介素 -8（IL-8）、血管内皮生长因子（VEGF）和组织因子）支持血管生成。动物模型研究表明，miR-7-5p 的过表达具有促动脉粥样硬化作用，与心血管疾病风险增加相关。二甲双胍作为一种广泛用于 2 型糖尿病一线治疗的口服双胍类药物，被证实具有心血管益处。基于以上背景，本研究旨在探索 T1DM 患者 CFU-Hill 集落中 miR-7-5p 的表达及其作为亚临床 CVD 生物标志物的潜力，以及二甲双胍对 miR-7-5p 表达的影响。
二、研究方法
（一）研究对象
研究纳入 29 名无 CVD 的 T1DM 患者和 20 名健康对照（HC），匹配年龄和性别。所有受试者均在纽卡斯尔大学转化与临床研究所招募，研究方案获得英国国家健康与护理研究伦理委员会批准，并获得所有受试者的知情同意。
（二）样本收集与检测指标
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血液样本收集 ：所有受试者在隔夜禁食后采集血液样本，用于检测血浆中的细胞因子水平、循环内皮祖细胞（cEPCs）、循环内皮细胞（cECs）和 CFU-Hill 集落数量。
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CFU-Hill 集落培养与检测 ：按照既定方法培养 CFU-Hill 集落，评估其数量和功能。
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miR-7-5p 检测 ：从血浆和 CFU-Hill 集落中提取总 RNA，采用 miRCURY LNA RT Kit 进行 miR-7-5p 的定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）检测。
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炎症标志物检测 ：使用特定的检测试剂盒检测血浆中的超敏 C 反应蛋白（CRP）和干扰素 -γ 诱导蛋白 10（IP-10）等炎症标志物水平。
（三）数据分析方法
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相关性分析 ：采用简单线性回归分析 miR-7-5p 与其他标志物（如 CRP、IP-10）之间的相关性。
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受试者工作特征曲线（ROC 曲线）分析 ：评估 miR-7-5p 作为亚临床 CVD 生物标志物的敏感性和特异性，确定其最佳截断值。
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通路分析 ：运用 Ingenuity Pathway Analysis（IPA）软件分析 miR-7-5p 的功能通路、细胞功能和靶基因，预测 miR-7-5p 在心血管疾病发展中的作用机制。
三、实验结果
（一）受试者的临床和代谢特征
研究共纳入 29 名 T1DM 患者和 20 名健康对照，两组在年龄和性别方面匹配良好。T1DM 患者的平均糖化血红蛋白（HbA1c）水平为 57.3 ± 7.6 mmol/mol，糖尿病病程为 22.4 ± 13.9 年，且均无记录的心血管事件。
（二）T1DM 患者与健康对照的比较
与健康对照相比，T1DM 患者的血浆中 CRP（p<0.001）和 IL-10（p=0.008）水平显著升高，CFU-Hill 集落数量（p=0.04）、循环祖细胞（CD34+/100 淋巴细胞 p<0.001 和 CD34+CD133+/100 淋巴细胞 p=0.013）显著降低。
（三）miR-7-5p 在 T1DM 和健康对照中的表达
CFU-Hill 集落中 miR-7-5p 的表达在 T1DM 患者中显著高于健康对照（p=0.015），而血浆中 miR-7-5p 表达在两组间无差异。经过 8 周二甲双胍治疗后，T1DM 患者 CFU-Hill 集落中 miR-7-5p 的表达显著降低（p<0.0001），其表达水平与健康对照相当。ROC 曲线分析显示，miR-7-5p 作为区分 T1DM 患者与健康对照的生物标志物具有较高的敏感性（90%）和特异性（78.6%），曲线下面积（AUC）为 0.8651（p=0.004）。此外，研究还确定了以 HbA1c 水平 44.3 mmol/mol（6.2%）为截断值时，miR-7-5p 表达上调，对应的 AUC 为 0.863（p=0.003），敏感性为 72.73%，特异性为 91.67%。miR-7-5p 与 HbA1c 呈正相关（p=0.027）。
（四）miR-7-5p 与炎症标志物的相关性
简单线性回归分析表明，miR-7-5p 与炎症标志物 CRP（r2=0.184，p=0.04）和 IP-10（r2=0.226，p=0.022）呈正相关。
（五）miR-7-5p 的功能通路和分子靶点
IPA 分析预测 miR-7-5p 具有抗血管生成作用，并在 T1DM 患者中显著上调。miR-7-5p 被证实可抑制 KLF4 的 mRNA 表达，从而抑制血管生成。同时，miR-7-5p 还可抑制 EGFR，导致动脉粥样硬化和 CXCL10/IP-10 激活，进一步促进动脉粥样硬化的发展。此外，miR-7-5p 抑制 IRS1、IGF1R、RAF1 和 IRS2 等基因的表达，激活心血管疾病和 CRP 表达。二甲双胍治疗被证明可抑制 miR-7-5p 表达，进而通过 TGFβ1 和 Smad2/3 通路激活 EGFR、RAF1、KLF4、IRS1、IGF1R 和 IRS2 等基因的表达，预测可抑制炎症反应、动脉粥样硬化、高血糖和心血管疾病的发生，并促进血管生成。
四、讨论
（一）miR-7-5p 在 T1DM 患者中的表达及其作为生物标志物的潜力
本研究首次在 T1DM 患者的 CFU-Hill 集落中检测到 miR-7-5p 表达上调，并通过二甲双胍干预后其表达恢复正常水平。这与动物模型中 miR-7-5p 的抗血管生成特性相一致。ROC 曲线分析进一步证实了 miR-7-5p 在亚临床 CVD 诊断中的高敏感性和特异性，表明 miR-7-5p 有望作为一种敏感且非侵入性的生物标志物，用于临床心血管疾病的管理。
（二）miR-7-5p 与炎症标志物的关联
研究发现 miR-7-5p 与 CRP 和 IP-10 水平呈正相关，这进一步支持了 miR-7-5p 在炎症反应中的促炎作用。CRP 作为一种急性时相反应蛋白，在动脉粥样硬化的发生发展中起着关键作用。IP-10 作为一种趋化因子，能够招募免疫细胞至血管损伤部位，参与动脉粥样硬化病变的形成。miR-7-5p 与这些炎症标志物的相关性提示其在 T1DM 患者的慢性炎症状态和血管内皮功能障碍中可能扮演重要角色。
（三）二甲双胍对 miR-7-5p 的调控作用
二甲双胍治疗后 miR-7-5p 表达显著下调，这为二甲双胍的心血管保护机制提供了新的分子证据。通过 IPA 分析预测，二甲双胍可能通过 TGFβ1 和 Smad2/3 通路抑制 miR-7-5p 表达，从而激活一系列与血管生成、胰岛素信号、抗炎和抗纤维化相关的基因表达。这表明二甲双胍不仅通过改善血糖控制发挥作用，还可能通过调节血管生物学和炎症反应对心血管系统产生有益影响。
（四）miR-7-5p 的下游靶基因及其在心血管疾病中的作用
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表皮生长因子受体（EGFR） ：EGFR 是一种跨膜蛋白酪氨酸激酶受体，广泛表达于多种细胞类型。动物研究表明，EGFR 基因敲除可导致心室重塑、心脏纤维化和炎症。miR-7 被证实可直接抑制 EGFR 表达，而 EGFR 的激活可提供对压力诱导损伤的心脏保护作用。
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胰岛素受体底物 1 和 2（IRS1/IRS2） ：IRS1 和 IRS2 是胰岛素信号通路中的关键蛋白，参与调节血糖代谢和心血管功能。研究表明，IRS1 和 IRS2 的缺失或功能障碍与心血管疾病风险增加相关。miR-7-5p 可通过抑制 IRS1 和 IRS2 的表达，影响胰岛素信号传导，进而参与心血管疾病的发病机制。
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Raf-1 原癌基因（RAF1） ：RAF1 是一种丝氨酸 / 苏氨酸激酶，参与调节细胞存活、增殖和迁移等过程。动物模型显示，RAF1 功能异常与心肌细胞凋亡、心脏肥大和心力衰竭等心血管疾病密切相关。miR-7-5p 能够显著降低 RAF1 的 mRNA 和蛋白表达，从而影响心血管系统的正常生理功能。
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类胰岛素样生长因子 1 受体（IGF-1R） ：IGF-1R 在调节心脏的自噬、肥大、代谢和凋亡等过程中发挥重要作用。研究表明，IGF-1R 的抑制可加剧心肌缺血 - 再灌注损伤后的心脏左心室收缩功能障碍，并且与心肌纤维化和炎症相关。
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Kruppel 样因子 -4（KLF4） ：KLF4 是一种转录因子，参与调节心脏巨噬细胞增殖、血管生成和内皮炎症。动物实验表明，KLF4 的缺失会影响心脏的血管生成和对压力过载的反应，增加心力衰竭的易感性和死亡率。
（五）临床应用前景
本研究为基于 miRNA 的心血管疾病治疗提供了新的靶点和思路。通过深入解析 miR-7-5p 的下游靶基因及其在心血管疾病中的作用机制，未来有望开发出针对这些靶点的精准治疗策略，以更有效地预防和管理心血管疾病。
五、结论
本研究通过在 T1DM 患者中探讨 CFU-Hill 集落中 miR-7-5p 的表达及其在二甲双胍干预下的变化，验证了 miR-7-5p 在血管健康评估中的重要性，并揭示了其作为亚临床 CVD 生物标志物的潜力。研究结果不仅加深了我们对 miR-7-5p 在心血管疾病中作用的理解，还为二甲双胍的心血管保护机制提供了新的分子层面的解释。尽管本研究存在一定局限性，如样本量相对较小、RNA 提取方法的局限性等，但其作为首次在 CFU-Hill 集落中研究 miR-7-5p 的探索性研究，为未来更大规模的临床研究奠定了基础，有望推动心血管疾病诊断和治疗领域的进一步发展。
| 名称 | 货号 | 规格 |
| V-PLEX Proinflammatory Panel1 (human) Kit (1 Plate) | K15049D-1 | 1Plate |
| V-PLEX Proinflammatory Panel1 (human) Kit (5 Plate) | K15049D-2 | 5Plate |
| V-PLEX Proinflammatory Panel1 (human) Kit (25 Plate) | K15049D-4 | 25Plate |
| LIPOFECTAMINE 3000- 0.1ML | L3000001 | 0.1mL |
