Coxsackievirus infection induces direct pancreatic β-cell killing but poor anti-viral CD8+ T-cell responses
一、引言
1型糖尿病（T1D）是一种自身免疫性疾病，其特征是胰岛β细胞被自身免疫系统破坏，导致胰岛素分泌不足。环境因素在T1D的发病机制中起着重要作用，其中柯萨奇病毒B型（CVB）感染被认为可能是触发因素之一。CVB感染与T1D之间的关联已经得到了一些流行病学研究的支持，但具体的分子机制尚不清楚。本文将深入解析一篇关于CVB感染对胰岛β细胞影响以及抗CVB特异性CD8+ T细胞应答的研究文献，探讨其在T1D发病中的作用和意义。
二、研究背景
CVB感染与T1D的发病存在时间上的相关性，且在一些T1D患者的胰腺组织中检测到了CVB的分子标记。此外，CVB感染在婴幼儿中较为常见，这与T1D的发病年龄相符。然而，CVB感染如何引发β细胞自身免疫以及抗病毒T细胞应答在其中扮演的角色仍然不明确。本研究旨在通过体外和体内实验，揭示CVB感染对β细胞的影响以及机体对CVB的免疫应答特点。
三、研究方法
（一）细胞培养与病毒感染
研究中使用了人源ECN90 β细胞系进行CVB感染实验。细胞在含有特定营养成分的培养基中培养，并在感染前用纤维连接蛋白和细胞外基质进行包被。CVB1和CVB3病毒株在HeLa细胞中扩增，经过冻融和超速离心后制备病毒 stocks，并用于感染ECN90 β细胞。感染后，细胞经过一系列处理，包括流式细胞术检测感染效率和细胞死亡情况，以及收集细胞用于后续的免疫肽组学分析。
（二）免疫肽组学分析
从CVB感染的β细胞中提取HLA-I复合物，并通过质谱分析鉴定与HLA-I结合的病毒肽。使用PEAKS 8.1软件对质谱数据进行分析，筛选出长度为8至12个氨基酸的病毒肽，并通过在线数据库和自建数据库进行序列比对，以确定这些肽段是否与CVB或其他β细胞抗原具有同源性。
（三）T细胞表型分析
利用多重HLA-I单体（MMr）技术，检测CVB感染后外周血单个核细胞（PBMCs）中特异性识别CVB肽的CD8+ T细胞。通过流式细胞术分析这些T细胞的频率、表型（包括效应/记忆表型和耗竭标记PD-1的表达）以及T细胞受体（TCR）的克隆重测序。
（四）细胞毒性实验
通过实时成像技术，观察CVB感染β细胞的死亡过程以及CVB特异性CD8+ T细胞对感染β细胞的杀伤作用。实验中使用了不同感染复数（MOI）和T细胞与β细胞比例，以评估CVB直接杀伤与T细胞介导杀伤的相对贡献。
四、研究结果
（一）CVB感染β细胞导致HLA-I表达下调和有限病毒肽呈递
CVB感染ECN90 β细胞后，细胞表面HLA-I表达显著下调，这一现象在感染后6小时即可观察到。通过免疫肽组学分析，在CVB感染的β细胞中鉴定出16个独特的CVB肽段，这些肽段占总鉴定肽段的2.9%，且大部分来源于CVB的非结构蛋白P2区域。此外，这些肽段在不同CVB血清型之间具有较高的保守性，并且在CVB1和CVB3感染的细胞中呈现出较高的重叠度。
（二）CVB特异性CD8+ T细胞应答有限
在CVB血清阳性健康成年人的PBMCs中，通过MMr技术检测到针对CVB肽的CD8+ T细胞应答，但其频率较低。大多数CVB特异性CD8+ T细胞表现出较低的效应/记忆表型，且在多数供体中，这些T细胞的频率低于10^{-5}。此外，CVB特异性CD8+ T细胞显示出较高的PD-1表达，表明其可能存在功能耗竭现象。在儿童供体中也观察到了类似的CD8+ T细胞应答模式，表明这种有限的免疫应答并非由于成人的长期免疫记忆衰退所致。
（三）CVB特异性CD8+ T细胞在组织中的分布和表型特征
在胰腺组织、脾脏和胰腺淋巴结（PLN）中均检测到了CVB特异性CD8+ T细胞，其中在PLN中这些T细胞的效应/记忆比例高于外周血。此外，CVB特异性CD8+ T细胞在T1D供体的PLN中显示出更高的PD-1+CD25−表型，这可能反映了这些细胞在慢性病毒感染中的耗竭状态。
（四）CVB感染β细胞的死亡机制
实时成像实验显示，CVB感染导致β细胞死亡的主要机制是病毒直接引起的细胞裂解，而非CVB特异性CD8+ T细胞的杀伤作用。CVB感染的β细胞通过形成丝状突起（filopodia）传播感染，这一过程可能有助于病毒在细胞间的扩散并逃避免疫监视。尽管CVB特异性CD8+ T细胞能够识别并杀死感染的β细胞，但在实验条件下，其杀伤作用仅在较高的T细胞与β细胞比例下才变得显著，且在低MOI感染条件下，CVB直接引起的细胞死亡仍然占主导地位。
五、研究讨论
（一）CVB感染对β细胞的影响
CVB感染β细胞后，不仅直接导致细胞死亡，还通过下调HLA-I表达减少了病毒肽的呈递，从而逃避免疫监视。此外，CVB通过形成丝状突起在细胞间传播，这可能进一步促进了病毒在胰腺组织中的扩散。这些机制共同作用，使得CVB能够在β细胞中持续存在并引发病理变化。
（二）抗病毒CD8+ T细胞应答的特点及意义
研究发现，CVB特异性CD8+ T细胞应答相对较弱，且存在功能耗竭现象。这种有限的抗病毒免疫应答可能不足以有效清除CVB感染，从而增加了病毒在β细胞中的持续存在和传播风险。CVB特异性CD8+ T细胞在胰腺相关淋巴组织中的富集表明，这些细胞可能在局部发挥一定的免疫监视作用，但其整体效应仍受到限制。
（三）对T1D发病机制的启示
CVB感染可能通过直接杀伤β细胞以及引发自身免疫反应共同促进T1D的发生。由于CVB特异性CD8+ T细胞应答较弱，无法有效清除感染的β细胞，持续的病毒感染可能导致β细胞反复受损，进而释放自身抗原，引发自身免疫反应。此外，CVB肽与β细胞自身抗原GAD之间存在交叉反应性，这可能进一步加剧自身免疫过程。
六、结论
本研究通过深入分析CVB感染β细胞后的免疫应答和细胞死亡机制，揭示了CVB在T1D发病中的潜在作用。研究发现CVB感染能够直接导致β细胞死亡，并且机体对CVB的CD8+ T细胞应答相对有限，这可能为T1D的免疫干预提供了新的视角。尽管CVB特异性CD8+ T细胞能够识别并杀死感染的β细胞，但其效果有限，且主要由病毒直接引起的细胞死亡占主导地位。这些发现为未来开发针对CVB的疫苗或抗病毒疗法以预防T1D提供了重要的科学依据。
图1：CVB感染β细胞后HLA-I表达下调及病毒肽呈递情况
（A）流式细胞术检测CVB3感染ECN90 β细胞后VP1/dsRNA表达、细胞死亡情况及HLA-I中位荧光强度变化。
（B和C）流式细胞术检测CVB感染6小时后β细胞HLA-I表达情况，包括HLA-I阳性细胞百分比和中位荧光强度。
（D）免疫肽组学实验流程图，展示从CVB感染的β细胞中提取HLA-I复合物、肽段洗脱、质谱分析及数据处理的步骤。
（E）CVB感染β细胞中鉴定出的CVB肽段占总鉴定8至12氨基酸肽段的百分比。
（F）CVB感染β细胞中鉴定出的病毒肽序列及其在CVB多蛋白中的映射位置，其中标记了与β细胞自身抗原GAD具有同源性的肽段。
图2：CVB特异性CD8+ T细胞应答的筛选结果
（A至C）HLA-A2限制性（A和B）和HLA-A3限制性（C）候选肽段的MMr检测结果。每个符号代表一名供体，横线表示中位值。上图显示MMr+CD8+ T细胞占总CD8+ T细胞的频率，中间图显示MMr+CD8+ T细胞计数，下图显示效应/记忆表型CD8+ T细胞占MMr+CD8+ T细胞的比例。验证阶段保留的肽段以灰色突出显示。
图3：CVB特异性CD8+ T细胞应答的验证结果
（A至D）HLA-A2限制性（A和B）和HLA-A3限制性（C和D）肽段的验证结果。每个符号代表一名供体，横线表示中位值。上图显示MMr+CD8+ T细胞占总CD8+ T细胞的频率，下图显示效应/记忆表型CD8+ T细胞占MMr+CD8+ T细胞的比例。验证阶段保留的肽段以灰色突出显示。
（E）CVB11132–1140与GAD272–280交叉反应性T细胞的检测结果，显示大多数T细胞同时识别这两种肽段。
图4：CVB特异性CD8+ T细胞在不同组织中的分布和表型特征
（A和B）nPOD器官供体脾脏中CVB特异性CD8+ T细胞的频率（A）和效应/记忆表型比例（B）。
（C）nPOD器官供体不同组织中CVB特异性CD8+ T细胞的频率。
（D）nPOD器官供体不同组织中PD-1+CD25−表型CVB特异性CD8+ T细胞的比例。
（E）CVB特异性CD8+ T细胞与流感病毒特异性CD8+ T细胞在PLN中PD-1+CD25−表型的比较。
（F）CVB特异性CD8+ T细胞在不同组织中的TCR CDR3β克隆重测序结果，显示扩增的克隆重在不同组织中存在重叠。
图5：CVB感染β细胞的死亡机制
（A和B）实时成像显示CVB3-eGFP感染ECN90 β细胞后的细胞死亡模式，（A）为病毒直接引起的单个细胞死亡，（B）为CVB特异性CD8+ T细胞介导的细胞团死亡。
（C）不同MOI和T细胞与β细胞比例下CVB引起的死亡（上）和T细胞引起的死亡（下）的百分比。
（D）在最后24小时内CVB引起的死亡与T细胞引起的死亡之间的相关性。
（E）低MOI感染协议，展示ECN90 β细胞在不同MOI下感染CVB-eGFP后的处理流程。
（F至H）低MOI感染条件下，CVB感染β细胞的感染情况（F）、细胞存活率（G）和HLA-I表达（H）随时间的变化。
（I和J）在低MOI感染条件下，CVB特异性TCR转导CD8+ T细胞对β细胞的杀伤效果，分别显示T细胞介导的死亡（I）和PPI特异性T细胞介导的死亡（J）。
（K）不同MOI下IFN-γ分泌情况。
表格1 ：CVB感染β细胞后鉴定出的病毒肽段信息
| 肽段编号 | 肽段序列 | 来源CVB蛋白区域 | 鉴定次数 | HLA限制性 | 预测结合亲和力（nM） | 与β细胞抗原同源性 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | GLFGQNMQY | P1（VP1） | 3 | HLA-A2 | 142 | 无 |
| 2 | LVQRVVYNA | P1（VP1） | 2 | HLA-A2 | 1852 | 无 |
| 3 | KLVQRVVYNA | P1（VP1） | 1 | HLA-A2 | 56 | 无 |
| 4 | RIYFKPKHV | P3（3A） | 1 | HLA-A3 | 16 | 无 |
| 5 | SILEKSLK | P2（2C） | 2 | HLA-A3 | 98 | 无 |
| 6 | YGIPMAERQ | P2（2C） | 1 | HLA-A3 | 317 | 无 |
| 7 | SLEKKMSNY | P2（2C） | 1 | HLA-A3 | 3016 | 无 |
| 8 | KINMPMSVK | P2（2C） | 1 | HLA-A3 | 17 | 与GAD272–280交叉反应 |
注：表格列出了CVB感染β细胞后通过免疫肽组学鉴定出的部分病毒肽段信息，包括肽段序列、来源CVB蛋白区域、鉴定次数、HLA限制性、预测结合亲和力以及与β细胞抗原的同源性。这些肽段是CVB特异性CD8+ T细胞识别的潜在靶点，其中部分肽段与β细胞自身抗原GAD存在交叉反应性。
| 名称 | 货号 | 规格 |
| V-PLEX Proinflammatory Panel1 (human) Kit (1 Plate) | K15049D-1 | 1Plate |
| V-PLEX Proinflammatory Panel1 (human) Kit (5 Plate) | K15049D-2 | 5Plate |
| V-PLEX Proinflammatory Panel1 (human) Kit (25 Plate) | K15049D-4 | 25Plate |
| RNeasy Mini Kit (250) | 74106 | 250Test |
