Trizol 法提取 RNA：原理、步骤及注意事项

Trizol 法提取 RNA

在分子生物学研究中，RNA 提取是许多实验的基础步骤，其质量直接关系到后续实验的成功与否。Trizol 法作为一种经典的 RNA 提取方法，以其高效、稳定的特点被广泛应用。本文将详细介绍 Trizol 法提取 RNA 的实验原理、主要试剂与仪器以及提取步骤，并探讨该方法的优势与局限性。

一、实验原理

Trizol 是一种酸性试剂，其主要成分为异硫氰酸胍（GITC）和苯酚，这种组合使其能够迅速从细胞和组织中分离 RNA。当 Trizol 试剂加入到样品中时，GITC 可以使蛋白质和 RNase 变性，从而有效保护 RNA 的完整性。随后，通过加入氯仿并离心，样品会分为水相、中间层和有机相。RNA 主要存在于上层水相中，而 DNA 和蛋白质则分布在中间层及下层有机相中。这一过程利用了 Trizol 试剂的裂解作用以及有机溶剂的分层特性，实现了 RNA 与其他组分的分离。简而言之，Trizol 法通过裂解细胞释放 RNA，并借助有机溶剂的分层作用，使 RNA 与 DNA 和蛋白质分离，进而通过进一步纯化获得高质量的 RNA。

二、主要的试剂、仪器与耗材

试剂：Trizol 试剂是该方法的核心试剂，其质量直接影响 RNA 提取的效果。氯仿用于使样品分层，异丙醇用于 RNA 的沉淀，75% 乙醇用于洗涤 RNA 沉淀，RNase free Water 用于溶解 RNA 沉淀。这些试剂的纯度和质量对实验结果至关重要。
仪器与耗材 ：低温冷冻离心机是 Trizol 法中不可或缺的设备，它能够在低温条件下进行高速离心，确保 RNA 的稳定性和完整性。匀浆器或组织研磨器用于组织样品的处理，使组织细胞充分裂解，释放 RNA。涡旋振荡器用于混合样品和试剂，保证反应的充分进行。金属浴可用于 RNA 沉淀的溶解过程，提高溶解效率。微量移液器用于精确取样和加样，保证实验的准确性。通风橱为实验提供了安全的操作环境，避免有害气体对操作人员的危害。计时器用于控制各步骤的反应时间，确保实验步骤的精确执行。1.5ml EP 管用于样品的收集和反应，其质量也会影响 RNA 的提取效果。

三、提取步骤

（一）样品的制备

细胞样品 ：根据细胞数量，按 1ml Trizol 试剂 /5-10×10^6 细胞的比例加入 Trizol 试剂。通常，当细胞在六孔板上生长至 80% 左右时，每孔收集的细胞加入 1ml Trizol 试剂即可。这样可以确保细胞充分裂解，同时避免试剂过量或不足对实验结果的影响。
组织样品 ：按 1ml Trizol 试剂 /50-100mg 组织的比例加入 Trizol 试剂，并在冰上进行匀浆处理，以利于 RNA 的释放。为了提高 RNA 的提取质量，组织可以先用液氮急冻后研磨处理，或者使用匀浆器或组织研磨器进行处理。在处理过程中，必须注意保持低温环境，因为高温可能会导致 RNA 降解，影响实验结果。

（二）氯仿抽提

每 1ml Trizol 试剂中加入 200ul 的氯仿，盖好 EP 管盖后，用手剧烈颠倒混匀 15s 左右，使样品充分混合。然后在室温下孵育 2-3min，使样品中的成分充分分层。接下来，在 2-8℃、12000g 的条件下离心 15min，样品会分为三层，从上到下依次为水相（RNA）、中间层及有机相（DNA、蛋白质等）。此时，需要小心谨慎地转移水相至新的 EP 管中，避免触及中间层，以免 RNA 受到污染。这一步骤的关键在于准确分离水相，确保 RNA 的纯度。

（三）异丙醇沉淀

每 1ml Trizol 试剂中加入 500ul 异丙醇，上下颠倒混匀后，在室温下孵育 10min。然后在 2-8℃、12000g 的条件下离心 10min，得到白色沉淀即为 RNA 沉淀。为了维持低温环境，防止 RNA 降解，建议提前将异丙醇预冷。这一步骤通过异丙醇的沉淀作用，将 RNA 从水相中分离出来，形成可见的沉淀，便于后续的洗涤和纯化。

（四）乙醇洗涤

弃去上清液后，加入 1ml 75% 乙醇（每 1ml Trizol 试剂）洗涤 RNA 沉淀。在 2-8℃、7500g 的条件下离心 5min。需要注意的是，75% 乙醇可以用无水乙醇和无酶水配制，并且最好进行预冷处理。在洗涤过程中，动作要轻柔，避免过于剧烈的操作导致 RNA 沉淀散开，以免在再次离心时 RNA 无法完全重聚，造成 RNA 的损失。这一步骤的目的是去除 RNA 沉淀中残留的杂质，提高 RNA 的纯度。

（五）溶解

弃去上清液后，在通风橱内干燥 RNA 沉淀 5-10min。干燥时间不可过长，否则会导致沉淀难以溶解，影响 RNA 的回收率和质量。然后用 50ul 左右的无酶水重悬沉淀，即可得到 RNA 溶液。为了提高溶解效率，也可以采用金属浴 60℃处理 5min。这一步骤将 RNA 沉淀溶解为溶液形式，便于后续的 RNA 质量检测和应用。

（六）RNA 质量的检测

微量分光光度计检测 ：纯 RNA 的 260/280 比值应在 2.0 左右。若比值偏小，可能表示 RNA 中存在蛋白或有机溶剂的污染；若比值偏大，则可能意味着 RNA 发生了降解。通过这一检测方法，可以快速评估 RNA 的纯度和质量。
琼脂糖凝胶电泳检测 ：在电泳结果中，一般可以看到三条带，从上往下依次为 28s RNA、18s RNA 及 5s RNA。正常情况下，5s 的带非常淡，甚至可能看不清，而 28s 带的亮度应为 18s 带亮度的 2 倍，且不存在拖尾现象，这表明 RNA 纯度较高。如果 5s 带非常明显，且 28s 与 18s 带的亮度差别不大，甚至出现涂抹状的条带，则高度提示 RNA 可能发生了降解。这一检测方法可以直观地观察 RNA 的完整性和降解情况，为实验结果的可靠性提供保障。

四、优势与局限性

（一）优势

高效性 ：Trizol 法能够在短时间内从大量样品中提取 RNA，适用于大规模实验。其提取过程相对快速，能够在数小时内完成 RNA 的提取和纯化，满足高通量实验的需求。
稳定性 ：该方法提取的 RNA 质量较高，能够保持 RNA 的完整性，适用于各种下游应用，如 RT-PCR、RNA 测序等。通过严格的实验操作和质量控制，可以确保 RNA 的稳定性和可靠性。
适用性广 ：Trizol 法适用于多种类型的样品，包括细胞和组织等。无论是动物细胞、植物组织还是微生物样品，都可以通过 Trizol 法提取高质量的 RNA，具有广泛的适用性。

（二）局限性

毒性问题 ：Trizol 试剂具有一定的毒性，操作过程中需要在通风良好的环境中进行，并采取适当的防护措施，如佩戴手套和口罩，避免对人体造成危害。这增加了实验操作的复杂性和安全隐患。
操作繁琐 ：与一些新型的 RNA 提取方法相比，Trizol 法的操作步骤相对繁琐，需要进行多次离心、转移和洗涤等操作，对实验人员的技术要求较高。这可能导致实验结果的不稳定性和重复性问题。
纯度有待提高 ：尽管 Trizol 法提取的 RNA 质量较高，但在某些情况下，RNA 中可能仍含有少量的蛋白质和 DNA 残留。对于一些对 RNA 纯度要求极高的实验，可能需要进一步纯化 RNA 样品，以满足实验需求。

综上所述，Trizol 法作为一种经典的 RNA 提取方法，在分子生物学研究中具有重要的地位。通过合理选择和优化实验条件，可以充分发挥其优势，克服其局限性，为后续的 RNA 研究和应用提供高质量的 RNA 样品。

名称	货号	规格
核酸酶与核酸清除剂	abs60331-250ml	250ml
Trizol	abs60154-100ml	100ml
Trizol（总RNA抽提试剂盒）	abs9331-1kit	1kit