Amgen团队在PROTAC研究领域取得重要突破：首次构建三元复合物亲和力与协同性预测降解效率的量化模型
Amgen的研究团队通过对SMARCA2和BRD4降解剂的系统性研究，在靶向蛋白降解领域取得了一项关键进展。他们首次成功建立了一个能够量化预测PROTAC降解效率的模型。该模型的核心在于将PROTAC介导形成的三元复合物（即靶蛋白-PROTAC-E3连接酶）的两个关键物理化学参数——三元复合物亲和力（KLPT）和协同性因子（α）——与降解活性直接关联起来。
核心发现与模型机制：
- 三元复合物亲和力（KLPT）决定降解效力： 研究发现，三元复合物与E3连接酶-靶蛋白复合物之间的亲和力（KLPT）是决定降解最终效力（通常用DC50表示，即达到50%降解所需的浓度，DC50越低效力越强）的主要因素。亲和力越高（KLPT值越低），降解效力通常越强。
- 协同性因子（α）驱动初始降解速率： 协同性因子（α）则主要影响蛋白降解的初始速率。当α > 1时，表明PROTAC分子在促进三元复合物形成方面具有协同效应，从而能够更快地启动降解过程。
- 界面埋藏表面积（BSA）是亲和力的关键结构基础： 通过分子动力学（MD）模拟，团队发现三元复合物界面的埋藏表面积（Buried Surface Area, BSA）与实测的KLPT值之间存在显著的负相关关系（Spearman相关系数 ρ = -0.8, p = 0.014）。这意味着界面接触面积越大，复合物结合越紧密，亲和力越高（KLPT越低）。
(图1参考：原文Fig1a 展示了PROTAC介导的靶蛋白降解机制示意图)
严谨的细胞内降解实验方法： 为了精确量化降解效果，研究采用了以下严谨的实验方案：
- 细胞模型： 使用人黑色素瘤A375细胞（ATCC CRL-1619），接种于96孔板（密度为2.5×10^5 细胞/孔）。
- 化合物处理： PROTAC化合物进行梯度稀释（通常为1:3稀释系列），分别处理细胞2小时（针对SMARCA2靶点）或4小时（针对BRD4靶点）。
- 蛋白定量技术： 采用高灵敏度的电化学发光技术（MSD，Meso Scale Discovery）进行靶蛋白水平的绝对定量。
- 细胞裂解： 处理后细胞使用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的专用MSD裂解缓冲液进行裂解。
- 免疫检测流程：
- 包被：使用针对靶蛋白（如SMARCA2）的特异性捕获抗体（浓度2μg/mL）在4℃条件下包被MSD板过夜。
- 封闭：使用3%牛血清白蛋白（BSA）溶液震荡封闭1小时，减少非特异性结合。
- 孵育：依次加入细胞裂解液（25μL/孔）、生物素化的检测抗体（25μL/孔）和标记了Sulfo-tag的二抗（25μL/孔）。
- 信号读取： 使用MSD超敏多因子电化学发光分析仪（型号SQ120 & S600）读取电化学发光信号，其强度与靶蛋白含量成正比。
(图2参考：原文Fig4a 展示了典型的SMARCA2降解剂量反应曲线)
数据分析方法：
- 数据归一化： 将原始信号数据转化为百分比降解率（Percent of Control, POC%）：
POC(%) = [(样品信号值 - 背景信号值) / (DMSO溶剂对照信号值 - 背景信号值)] × 100 - DC50计算： 对剂量反应曲线（POC% vs. log[浓度]）进行四参数逻辑回归（4PL）拟合，计算出达到50%降解（即POC=50%）时对应的PROTAC浓度（DC50）。
- 降解效力与效率量化（AUC）： 使用梯形法对剂量反应曲线下面积（Area Under the Curve, AUC）进行积分计算：
AUC = Σ [1/2 × (POC_n + POC_{n+1}) × Δlog(浓度_n)]AUC值综合反映了PROTAC在整个浓度范围内的降解效力（最大降解深度）和效率（达到有效降解所需的浓度），AUC越小通常表示降解能力越强。 - 初始降解速率常数： 通过分析单剂量PROTAC处理下靶蛋白水平随时间变化的曲线（时间过程实验），并利用一相衰减模型进行拟合，推导出初始降解速率常数。
(图3参考：原文Fig4c 展示了AUC与三元复合物亲和力KLPT之间的显著相关性)
关键研究结论：
- 连接子设计的影响： PROTAC分子中连接靶蛋白配体和E3连接酶配体的连接子（Linker）长度对协同性因子α有显著影响。例如，增长连接子（如化合物7和8）会导致α值大幅降低（降至0.11），从而削弱了初始降解速率。
- 靶蛋白依赖性： 不同靶蛋白的降解机制存在差异：
- 对于SMARCA2，降解的初始速率主要由协同性因子α驱动。具有高α值（如α=12.8的化合物1）的PROTAC能实现最快的初始降解速率。
- 对于BRD4，三元复合物的稳定性（即其半衰期）对降解效力更为关键。例如，形成半衰期长达130秒的三元复合物的PROTAC MZ1，展现出了最强的降解效力。
- 计算模型的预测能力： 分子动力学模拟计算得到的三元复合物界面埋藏表面积（BSA）与通过表面等离子共振（SPR）实验实测的KLPT值之间存在强负相关性（ρ = -0.8），验证了结构参数预测亲和力进而预测降解活性的可行性。
(图4参考：原文Fig7d 展示了界面埋藏面积BSA与三元复合物亲和力KLPT的负相关关系图)
研究的重大意义： 这项研究具有里程碑意义，因为它首次通过一个严谨的数学框架（包含如公式3-5等核心方程），将利用SPR技术测量的三元复合物关键参数——亲和力（KLPT）和协同性（α）——与细胞内的实际靶蛋白降解活性（如DC50、初始降解速率v）建立了定量的预测关联关系。该模型的核心公式之一描述了降解速率v： v = Vmax / [(1 - KLPT/KLP) + (1 + [P]t/KLP)^2 * KLPT / ([P]t + [T]t + KTP - √( ... ))] (注：公式可能未完整显示，以原文为准) 这一突破为PROTAC的理性设计提供了强大的新范式。未来设计高效PROTAC分子时，可以优先优化其诱导形成的三元复合物的亲和力（KLPT）和协同性（α），并参考结构模拟预测的界面BSA，从而显著提高研发的成功率和效率。
