EGFP mRNA(N1-Methylpseudo-UTP)

在生命科学研究的广阔天地里，实时、直观地追踪细胞的行为、命运和分子动态，始终是科学家们孜孜以求的目标。荧光蛋白，特别是源自维多利亚多管发光水母的增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP），自其被发现和应用以来，已成为照亮微观生命世界的革命性工具。它无需外源底物，在蓝光激发下即可发出明亮的绿色荧光，且具有相对较好的光稳定性和低细胞毒性，使其成为标记基因表达、追踪蛋白定位、研究细胞迁移、甚至进行活体成像的“金标准”报告分子。

然而，传统的EGFP表达依赖于将编码其的DNA序列（如质粒）导入细胞，依赖细胞自身的转录机制进行表达。这个过程存在一些固有的局限：转染效率因细胞类型而异、表达启动存在延迟（需要经历转录和翻译两个过程）、DNA整合带来的基因组扰动风险、以及在原代细胞或难转染细胞中效率低下等。近年来，体外转录（In Vitro Transcription, IVT）合成的信使RNA（mRNA）技术异军突起，为蛋白质的瞬时表达提供了强有力的替代方案。直接将编码目标蛋白的mRNA递送到细胞质中，可以绕过转录步骤，直接利用细胞的翻译机器快速合成蛋白，大大缩短了表达时间窗，提高了效率，并且避免了基因组整合的风险。今天，我们就来聚焦一款基于mRNA技术、并进行了关键优化的产品——N1-Methylpseudo-UTP修饰的EGFP mRNA (abs60176-A)，深入探讨其设计原理、技术优势以及在科研实践中的应用价值和注意事项。

核心价值：快速、高效、无基因整合的荧光报告

这款产品的核心使命，就是为研究人员提供一种能够快速、高效、安全地在哺乳动物细胞中表达EGFP蛋白的工具。其应用场景极其广泛：

转染效率评估： 这是最基础也是最常用的功能。在进行重要的基因功能研究（如CRISPR敲除/敲入、过表达、RNAi等）之前，或者测试新型转染试剂（如脂质体、电穿孔参数）时，将EGFP mRNA与待测体系共转染，通过观察绿色荧光的强度和分布，可以直观、快速地评估该体系将核酸递送到细胞内的效率以及细胞的状态（健康的细胞才能有效翻译mRNA）。相比EGFP质粒，mRNA的表达通常在几小时内即可显现，大大缩短了实验周期。

细胞示踪与命运追踪： 将EGFP mRNA导入特定细胞（如干细胞、免疫细胞、肿瘤细胞），可以标记这些细胞。随后，可以通过荧光显微镜或流式细胞术追踪这些被标记细胞在体外（如共培养、迁移实验）或体内（如移植后）的位置、增殖、分化和归巢行为。

启动子/调控元件活性研究： 虽然mRNA本身不依赖启动子，但在研究非编码RNA（如miRNA）对基因表达的调控时，可以将含有特定调控序列（如miRNA靶位点）的EGFP mRNA与miRNA模拟物或抑制剂共转染，通过荧光强度的变化来定量评估该miRNA对目标mRNA稳定性和翻译效率的影响。

蛋白质定位研究： 虽然EGFP本身是均质分布的，但将其作为标签融合到其他蛋白的N端或C端（这需要定制的mRNA），可以用于研究该融合蛋白在细胞内的亚细胞定位和动态变化。mRNA表达的快速性有助于捕捉早期定位事件。

药物筛选与毒性评估： 在筛选影响特定信号通路或细胞功能的化合物时，可以将通路下游报告基因（如EGFP）的mRNA作为快速响应的读出指标。或者，利用EGFP mRNA的表达效率作为细胞活力的间接指标，评估药物或环境因素的细胞毒性。

 

技术亮点：超越基础mRNA的优化设计

abs60176-A并非简单的体外转录产物，它融合了多项关键的优化技术，旨在最大化其翻译效率和稳定性，同时最小化不必要的免疫原性，这正是其作为优质科研工具的核心竞争力所在：

N1-Methylpseudo-UTP修饰：降低免疫原性，提升稳定性与翻译效率

• 问题背景： 传统的体外转录mRNA使用普通的尿苷三磷酸（UTP）作为原料。然而，细胞具有精密的模式识别受体（如TLR3, TLR7/8, RIG-I, MDA5），能够识别外源RNA的特定分子模式（如未修饰的尿苷），将其视为“危险信号”（PAMPs, Pathogen-Associated Molecular Patterns），从而触发强烈的先天免疫反应（如I型干扰素分泌）。这种免疫激活不仅会干扰实验结果的解读（例如，影响细胞增殖、分化或目标蛋白功能），还会通过激活蛋白激酶R（PKR）和2'-5'寡腺苷酸合成酶（OAS）通路，导致全局性的翻译抑制和mRNA降解，严重削弱目标蛋白（如EGFP）的表达。
• 解决方案： 本产品在合成过程中，使用N1-Methylpseudo-UTP 完全取代了普通的UTP。这是一种经过化学修饰的核苷酸类似物。
  • 免疫逃逸： N1-甲基假尿苷修饰能有效“伪装”mRNA，使其不被细胞的固有免疫受体识别为外源物质。大量研究表明，这种修饰能显著降低mRNA诱导的I型干扰素等炎性细胞因子的产生。
  • 增强稳定性： 该修饰还可能通过改变RNA的二级结构或减少核酸酶的识别位点，在一定程度上提高mRNA在细胞质中的稳定性，延长其半衰期。
  • 提升翻译效率： 更重要的机制在于，降低免疫反应直接避免了PKR和OAS通路介导的翻译抑制。细胞不再处于“抗病毒”状态，核糖体能够更高效地加载到mRNA上并进行蛋白质合成。多项研究证实，N1-甲基假尿苷修饰的mRNA比未修饰的mRNA具有显著更高的蛋白产率。这对于需要高亮度荧光信号的应用（如弱表达细胞或精细成像）至关重要。

Cap1结构：确保高效翻译起始

• 问题背景： mRNA的5'端帽子结构（Cap）对于其稳定性、出核转运以及最重要的——翻译起始，具有决定性作用。真核细胞翻译起始因子eIF4E特异性地识别Cap结构（m⁷GpppN，即Cap 0），这是招募核糖体复合物的关键第一步。然而，体外转录常用的Cap类似物（如m⁷GpppG）通常产生Cap 0结构（mRNA的第一个核苷酸未被甲基化）。
• 解决方案： 本产品采用了优化的加帽工艺，确保产生高比例的Cap1结构（m⁷GpppNmN），即mRNA的第一个核苷酸（紧邻帽子后的核苷酸）的2'-O位也被甲基化。
  • 提升翻译效率： Cap1结构是哺乳动物细胞中最常见、也是被翻译机制识别效率最高的帽子形式。它能更有效地结合eIF4E，促进翻译起始复合物的组装，从而进一步提高蛋白产量。
  • 降低免疫原性： Cap1结构还能被某些识别Cap 0为“非我”的免疫受体（如IFIT家族蛋白）所忽略，进一步辅助降低免疫原性。Cap1结构与N1-甲基假尿苷修饰协同作用，共同打造了高效、低免疫原性的mRNA。

密码子优化：适配哺乳动物细胞偏好

• 问题背景： 不同生物甚至不同细胞类型对编码同一氨基酸的同义密码子存在使用偏好性。使用稀有密码子可能导致翻译速度减慢甚至暂停，影响蛋白产量和折叠效率。原始的EGFP基因序列来源于水母，其密码子使用频率与哺乳动物细胞并不完全匹配。
• 解决方案： 本产品的EGFP mRNA序列经过了密码子优化。即在不改变EGFP氨基酸序列的前提下，将编码序列中的密码子替换为哺乳动物细胞（特别是人类细胞）最常用的同义密码子。这确保了tRNA的丰度与密码子需求相匹配，使核糖体能够更顺畅、更快速地进行翻译，最大化EGFP蛋白的合成速率和产量。

优化的UTR与polyA尾：精细调控翻译与稳定性

• 5' UTR (非翻译区)： 本产品使用了经过优化的5' UTR序列。一个好的5' UTR应该具备以下特点：长度适中、避免形成复杂的二级结构（以免阻碍核糖体扫描）、不包含上游开放阅读框（uORF，会竞争性抑制主ORF的翻译）、并且可能包含促进翻译的特定序列元件（如Kozak序列的优化版本）。
• 3' UTR (非翻译区)： 同样采用了优化的3' UTR。3' UTR在mRNA稳定性、定位和翻译效率调控中扮演重要角色。优化的3' UTR可能包含稳定mRNA的元件（避免富含AU的不稳定元件），有时也会加入已知能增强翻译效率的序列。
• PolyA尾： mRNA的3'端带有一个足够长的PolyA尾（通常>100个腺苷酸）。PolyA尾通过与PolyA结合蛋白（PABP）结合，形成闭环结构（通过eIF4G与5' Cap相连），这对于维持mRNA稳定性、防止其被外切酶降解以及促进有效的翻译再起始至关重要。本产品明确说明优化了polyA结构，确保其长度和完整性足以发挥这些功能。

应用要点：发挥最大效能的关键操作

理解了产品的核心价值和技术优势后，如何在实验中正确使用abs60176-A以达到最佳效果，就显得尤为重要。以下几点是实验成功的关键：

高浓度储备液： 产品以1 mg/mL (1 μg/μL) 的高浓度提供。这非常有利于进行精确的稀释和减少加入体系的体积，避免对细胞造成额外的体积或溶剂压力。

严苛的储存与分装：RNA的脆弱性

• 核心温度：低于-40°C。 这是产品说明书中强调的关键点。RNA分子极其脆弱，无处不在的RNase（核糖核酸酶）可以在室温下迅速将其降解。低温（-80°C是金标准，-40°C是产品要求的最低限）能最大程度地抑制RNase活性和化学降解反应。
• 分装策略： 说明书强烈建议：“如果需要反复冻融与反复使用，请在第一次使用时做好分装”。反复冻融是RNA样品降解的主要原因之一。每次冻融循环都会导致冰晶形成、局部浓度变化等物理损伤。最佳做法是在首次使用时，根据单次实验的用量（例如，每次转染需要5μL），用无RNase的离心管进行分装，并立即储存于-80°C或-40°C。每次实验只取出一管分装好的mRNA使用，避免整管反复冻融。
• 无RNase环境： 操作全程必须使用RNase free的试剂、环境与操作规范。这包括：
  • 耗材： 使用无RNase的离心管、枪头（最好是一次性，预灭菌的）。
  • 试剂： 稀释mRNA必须使用无RNase的水或缓冲液（如产品溶剂：1mM Sodium Citrate, pH 6.4，或其他经过DEPC处理或购买的无RNase缓冲液）。
  • 操作台面： 使用前用RNase清除剂（如RNaseZap或含DEPC的溶液）仔细擦拭台面、移液器表面等。
  • 操作者： 佩戴手套，避免用手直接接触管口、枪头内部等。勤换手套。
  • 低温操作： 在冰上或冷台上进行稀释等操作，减少室温暴露时间。

溶剂信息： 产品溶解在1mM Sodium Citrate, pH 6.4 的缓冲液中。柠檬酸钠提供了一个相对温和的缓冲环境。在稀释或用于转染时，需要注意该缓冲液的离子强度和pH是否与你使用的转染试剂兼容。如果不确定，建议查阅转染试剂说明书或进行预实验优化。通常，少量mRNA加入转染复合物中不会显著改变体系条件。

时效性：新鲜是关键

• 说明书明确指出：“该产品为短效期品，爱必信所提供的均为新鲜生产的产品，为了达到最佳使用效果，请在收到货物的2个月内使用。” 这是基于RNA固有的不稳定性。即使在严格储存条件下，随着时间推移，降解也会缓慢发生，导致有效浓度下降和片段化增加，最终影响表达效率（荧光强度减弱、表达细胞比例降低）。
• 强烈建议： 收到产品后，尽快规划实验，并在2个月的有效期内使用完毕。购买时也应考虑实验需求，避免过量囤积。分装储存有助于减缓单次使用分装的降解速度，但并不能无限期延长整体产品的有效期。

应用范围：科研专用

• 产品说明强调：“本产品仅作科研实验使用，不支持临床等研究”。这意味着它适用于体外细胞实验（in vitro）或动物实验（in vivo）中的基础研究、药物筛选等科研目的。其生产工艺、质量控制标准、以及未进行全面的临床前/临床安全性评价，均决定了它不能用于人体治疗或诊断。

总结

N1-Methylpseudo-UTP修饰的EGFP mRNA (abs60176-A) 是一款融合了多项先进mRNA技术的优质科研工具。其核心价值在于为哺乳动物细胞研究提供了一种快速（绕过转录）、高效（高修饰、Cap1、密码子优化）、安全（无基因组整合风险）且可视化（EGFP报告） 的蛋白表达手段。关键的N1-Methylpseudo-UTP修饰是其在细胞内实现高效、低免疫原性表达的核心技术保障，显著优于传统的未修饰mRNA。结合高比例Cap1结构、哺乳动物密码子优化、以及精心设计的UTR和polyA尾，该产品能够最大化EGFP的翻译输出，产生明亮、可靠的荧光信号。

然而，RNA固有的脆弱性要求使用者必须严格遵守操作规程：严格低温储存（<-40°C）、务必进行分装以避免冻融、全程无RNase操作、并在收到货后2个月内使用完毕。忽视任何一点都可能导致实验失败或结果不可靠。

当您需要快速评估转染效率、追踪细胞命运、研究基因调控或进行相关筛选时，这款经过多重优化的EGFP mRNA无疑是一个强大而可靠的选择。理解其背后的技术原理并严格遵守操作规范，将帮助您在探索生命奥秘的征途上，点亮更多清晰的“绿色灯塔”。

 

名称	货号	规格
EGFP mRNA(N1-Methylpseudo-UTP)	abs60176-A-100ug	100ug
EGFP mRNA(N1-Methylpseudo-UTP)	abs60176-A-100ug×5	100ug×5
EGFP mRNA(N1-Methylpseudo-UTP)	abs60176-A-100ug×10	100ug×10