β-Amyloid in blood neuronal-derived extracellular vesicles is elevated in cognitively normal adults at risk of Alzheimer's disease and predicts cerebral amyloidosis
一、研究背景与核心问题
阿尔茨海默病（AD）的病理进程在临床症状出现前数十年即已启动，其特征性病理改变为β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积形成的老年斑和过度磷酸化Tau蛋白构成的神经原纤维缠结。目前AD的确诊依赖于脑脊液检测或淀粉样蛋白正电子发射断层扫描（amyloid-PET），但二者均存在侵入性高、费用昂贵或普及度低的问题。因此，开发基于血液的生物标志物对实现AD的早期筛查和干预至关重要。
神经元源性细胞外囊泡（neuronal-derived extracellular vesicles, nEVs）是近年备受关注的生物标志物载体。它们由神经元释放，可穿过血脑屏障进入外周循环，携带反映神经元状态的生物分子（如Aβ、Tau蛋白）。本研究聚焦于血浆nEVs中的Aβ42，旨在解决两个关键问题：
- nEV Aβ42在AD连续体（从认知正常但脑Aβ沉积阳性[Aβ+NCs]到AD痴呆[ADD]）中的动态变化规律
- nEV Aβ42与脑淀粉样蛋白沉积（amyloid-PET）、脑区体积（sMRI）及认知功能纵向变化的关联性
理论依据：
nEVs通过免疫沉淀法（anti-CD171抗体）从血浆中分离，其神经元特异性由标志物Tubb3/SNAP25确认（Western blot验证）。囊泡内Aβ42采用单分子阵列技术（Simoa）检测，灵敏度达飞克级，克服了传统ELISA法的灵敏度限制。
二、研究方法与队列设计
1. 研究队列
研究基于“中国认知衰退纵向研究（SILCODE）”，纳入246名参与者：
- 84名 Aβ- NCs（认知正常且脑Aβ阴性）
- 72名 Aβ+ NCs（认知正常但脑Aβ阳性）
- 45名 aMCI（遗忘型轻度认知障碍）
- 45名 ADD（AD痴呆）
所有受试者均接受神经心理学评估（MMSE、MoCA-B、AVLT等）、APOE基因分型和脑影像学检查（表1）。
表1：受试者基线特征
| 组别 | Aβ- NCs (n=84) | Aβ+ NCs (n=72) | aMCI (n=45) | ADD (n=45) |
|---|---|---|---|---|
| 年龄（岁） | 65.3 ± 5.5 | 67.2 ± 6.6 | 69.6 ± 6.8 | 73.9 ± 8.8 |
| APOE4携带率 | 27.4% | 44.4% | 53.3% | 68.9% |
| AV45 SUVR | 1.096 ± 0.059 | 1.241 ± 0.060 | 1.390 ± 0.085 | 1.419 ± 0.084 |
| 内嗅皮层体积/TIV | 4.226 ± 1.251 | 3.933 ± 1.206 | 3.479 ± 1.217 | 2.317 ± 0.834 |
注：#p<0.05 vs Aβ-NCs；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；SUVR：标准化摄取值比；TIV：颅内总体积
2. 关键技术流程
-
nEV分离与验证：
血浆经Exoquick®沉淀后，用抗CD171抗体免疫沉淀富集nEVs。通过透射电镜（TEM）确认囊泡形态（直径≈150 nm），纳米颗粒追踪分析（NTA）定量浓度，Western blot验证神经元标志物（Tubb3/SNAP25）和纯度标志物（Albumin/GM130阴性）。 -
生物标志物检测：
- nEV Aβ42/Aβ40：Simoa Neurology 4-Plex E试剂盒
- 血浆Aβ42/Aβ40：电化学发光法（MSD平台）
- 脑Aβ沉积：¹⁸F-florbetapir (AV45) PET，SUVR>1.18定义为Aβ阳性
- 脑结构体积：3T MRI，CAT12工具箱分析海马、内嗅皮层等区域体积
三、核心研究结果
1. nEV Aβ42沿AD连续体梯度升高
在调整囊泡浓度至3×10⁸颗粒后，nEV Aβ42呈现明显的疾病进展相关性：
- Aβ-NCs：1.592 ± 0.852 pg/mL
- Aβ+NCs：2.406 ± 1.417 pg/mL（较Aβ-NCs升高51%，p<0.05）
- aMCI：3.593 ± 1.699 pg/mL（较Aβ+NCs升高49%，p<0.01）
- ADD：5.853 ± 2.880 pg/mL（较aMCI升高63%，p=0.086）
图1：nEV Aβ42浓度在AD连续体中的变化
图1（A）nEV Aβ42浓度；（B）nEV Aβ40浓度；（C）Aβ42/Aβ40比值无组间差异；（D）Aβ42与Aβ40显著正相关（R=0.811）
2. nEV Aβ42的诊断效能
ROC曲线分析显示，nEV Aβ42对区分不同疾病阶段具有优异性能：
- 区分Aβ+NCs与Aβ-NCs：AUC=0.663
- 区分aMCI与NCs（含Aβ+）：AUC=0.791
- 区分ADD与NCs：AUC=0.957
联合APOEε4状态可将Aβ+NCs的识别AUC提升至0.705（图1E-F）。
表2：nEV Aβ42的诊断效能（ROC AUC）
| 对比组 | nEV Aβ42单独 | nEV Aβ42 + APOEε4 |
|---|---|---|
| Aβ-NCs vs Aβ+NCs | 0.663 | 0.705 |
| Aβ-NCs vs aMCI | 0.857 | 0.873 |
| Aβ-NCs vs ADD | 0.957 | 0.965 |
3. nEV Aβ42与脑淀粉样蛋白沉积强相关
nEV Aβ42水平与全局AV45 SUVR显著正相关（R=0.532, p<0.001），且这种关联在Aβ+NCs（R=0.417–0.570）和认知障碍患者中持续存在（表3）。线性回归显示，nEV Aβ42可解释脑Aβ沉积变异的41.1%。
图3：nEV Aβ42与AV45 SUVR的相关性
图3（左）总人群；（右）按诊断分组
表3：nEV Aβ42与脑区AV45 SUVR的偏相关分析
| 脑区 | 总人群 (R) | Aβ+NCs (R) |
|---|---|---|
| 左侧颞叶 | 0.462 | 0.418 |
| 右侧颞叶 | 0.549 | 0.538 |
| 左侧顶叶 | 0.570 | 0.466 |
| 右侧顶叶 | 0.603 | 0.457 |
| 内嗅皮层 | 0.444 | 0.381 |
注：***p<0.001；**p<0.01；校正年龄、性别、APOEε4状态
4. nEV Aβ42预测认知衰退与脑萎缩
在104名接受纵向评估的受试者中，基线nEV Aβ42水平与以下指标显著相关：
- 认知功能下降：MMSE评分年化下降率（R=0.454, p<0.001）
- 内嗅皮层萎缩：体积年化变化率（R=0.362, p<0.001）
图4：nEV Aβ42与纵向变化的关联
图4（A）MMSE变化；（B）MoCA-B变化；（C）基线内嗅皮层体积；（D）内嗅皮层年化萎缩率
四、讨论与意义
1. 方法学创新与优势
本研究通过CD171免疫沉淀富集nEVs，解决了外周血EVs来源混杂的问题。Simoa技术的应用使nEV内低丰度Aβ42的精准定量成为可能（灵敏度比ELISA高1000倍）。与传统血浆Aβ相比，nEV Aβ42具有显著优势：
- 血浆Aβ42：在NCs、aMCI、ADD间无差异（图2）
- nEV Aβ42：梯度升高且与PET金标准强相关
图2：血浆Aβ与nEV Aβ诊断效能对比
2. 临床转化价值
- 早期筛查：nEV Aβ42可识别脑Aβ沉积阳性但认知正常的AD高危人群（Aβ+NCs），为超早期干预提供窗口期。
- 疾病监测：其浓度梯度反映AD病理进展程度（Aβ-NCs→ADD）。
- 预后预测：基线水平可预测内嗅皮层萎缩速率（AD最早受累脑区）。
3. 局限性
- 样本量较小（尤其纵向队列）
- nEV分离流程复杂，临床推广需简化
- 缺乏tau病理数据（p-tau181/NFL未检出）
- 未纳入其他神经退行性疾病对照
五、结论
本研究证实：
- 血浆nEV Aβ42是AD连续体的敏感生物标志物，其浓度从Aβ-NCs到ADD逐步升高。
- nEV Aβ42可识别脑Aβ沉积阳性的认知正常个体（AUC=0.663），联合APOEε4可提升至0.705。
- nEV Aβ42与脑淀粉样蛋白沉积（PET SUVR）显著正相关（R=0.532），并预测认知衰退和内嗅皮层萎缩。
该标志物为AD的早期诊断、风险分层和临床试验入组提供了新型液体活检工具，未来需通过多中心研究验证其临床适用性。
| 名称 | 货号 | 规格 |
| V-PLEX Vascular Injury Panel 2(human) Kit (25 Plate) | K15198D-4 | 25Plate |
| V-PLEX Vascular Injury Panel 2(human) Kit (5 Plate) | K15198D-2 | 5Plate |
| V-PLEX Vascular Injury Panel 2(human) Kit (1 Plate) | K15342K-4 | 25PL |
