Decoding the activated stem cell phenotype of the neonatally maturing pituitary

一、引言：垂体干细胞在发育与再生中的核心地位

垂体作为内分泌系统的中枢调控器官，其发育成熟过程涉及复杂的细胞动态变化。小鼠出生后早期（新生儿期，postnatal day 7, PD7）是垂体经历剧烈成熟的关键窗口期，此时激素细胞（如生长激素细胞、催乳素细胞）数量显著扩增，同时干细胞（SOX2⁺）呈现高度活化状态。本研究通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）、类器官模型及基因敲除小鼠等多维度技术，系统解析了新生儿垂体干细胞的活化表型，揭示了其独特的上皮-间质混合表型（hybrid E/M phenotype） 和WNT信号通路主导的活化机制（图1）。研究进一步发现，与成年垂体相比，新生儿垂体具有更强的损伤再生能力，为垂体再生医学提供了新的理论基础。

二、单细胞转录组揭示新生儿垂体的动态发育景观

1. 细胞图谱构建与干细胞特征

研究对PD7小鼠垂体前叶（AP）进行scRNA-seq分析，并与成年数据整合（图1A）。结果显示：

• 干细胞群（SC1、SC2）丰度更高：新生儿垂体干细胞数量是成年个体的3–4倍（图1A右），且增殖性干细胞亚群（Prolif SC）仅在新生儿中显著存在（图1B）。
• 干细胞活化标志：增殖性干细胞高表达细胞周期基因（Mki67、Pcna），而GO分析显示其富集于“细胞分裂”“DNA复制”等通路（图1附图2A）。
• 激素细胞动态变化：新生儿中存在增殖性Pou1f1⁺细胞（生长激素/催乳素/促甲状腺素的前体）和促肾上腺皮质激素细胞（Cortico），表明内分泌细胞处于活跃扩增阶段（图1附图2B）。

2. 干细胞表型的核心特征：上皮-间质混合状态

scRNA-seq显示新生儿干细胞同时高表达上皮标志物（Krt8、Krt18）和间质标志物（Vim、Fn1），而成年干细胞以上皮表型为主（图1C）。免疫荧光验证：

• 共定位证据：新生儿垂体边缘带（MZ）干细胞巢中，SOX2⁺细胞共表达CK8/18（上皮）和VIM（间质），而成年中此类共表达显著减少（图1C下图）。

生物学意义：这种混合表型常见于发育中的组织干细胞（如肺、肠道），暗示其参与垂体结构重塑与细胞迁移（如胚胎期干细胞向腺实质迁移）。

三、类器官模型重现新生儿垂体干细胞活化表型

1. 类器官培养体系的优化

研究建立新生儿垂体类器官模型（图2A），发现：

• 培养基优化：经典垂体类器官培养基（PitOM）中的FGF/IGF等因子对新生儿干细胞非必需，而核心因子RSpECT（RSPO1、p38i、EGF、Cholera toxin）可显著提升类器官形成效率（图2B）。
• 干细胞起源验证：Sox2-eGFP⁺小鼠来源的细胞仅形成eGFP⁺类器官，且活体成像证实其起源于单个干细胞（图2附图1C–D）。

2. 类器官反映干细胞的活化与旁分泌功能

• 活化状态重现：新生儿类器官形成效率显著高于成年（图2B），且干细胞增殖指数（Ki67⁺）更高。
• 旁分泌效应：将新生儿类器官与成年类器官共培养，可激活成年干细胞的增殖（图2D），表明新生儿干细胞具有**“信号中心”功能**，通过分泌因子调控微环境。

3. IL-6家族因子的功能冗余性

尽管IL-6在成年垂体损伤后激活干细胞，但在新生儿中：

• 表达水平低：scRNA-seq显示新生儿干细胞Il6表达量低于成年（图2附图2A）。
• 类器官中的非必需性：IL-6敲除（Il6⁻/⁻）新生儿的垂体干细胞在体表型正常（图2附图3A），但类器官形成数量减少（图2E）。添加IL-6家族成员（LIF、IL-11）可替代IL-6促进类器官扩增（图2F），表明该家族通过JAK-STAT通路共同维持干细胞活性（图2附图3G）。

四、WNT通路驱动新生儿垂体干细胞活化的核心机制

1. 转录组证据：WNT通路在新生儿干细胞的富集

• 差异基因分析：新生儿干细胞高表达WNT通路基因（Fzd2/3、Ctnnb1、Tnks）（图3A）。
• 通路活性验证：GO与GSEA分析显示“WNT信号传导”“β-catenin降解”等通路显著富集（图3B）。
• 转录因子调控：TCF7L1/2调节子（regulon）活性在新生儿干细胞中更高（图3C），提示WNT下游转录程序活跃。

2. 微环境互作：间质细胞（MC）与干细胞的WNT信号对话

CellPhoneDB预测MC与干细胞间存在多组配体-受体互作：

• WNT5A-FZD轴：MC高表达Wnt5a，干细胞表达受体Fzd1/3/6（图3D）。
• RSPO3-LGR轴：MC分泌RSPO3（WNT增强子），干细胞表达LGR4/6受体（图3附图1D），RNA原位杂交证实Lgr4/6在SOX2⁺细胞中表达（图3附图1D）。

3. 功能验证：WNT通路对干细胞活化的必要性

• 类器官实验：添加WNT抑制剂（XAV939、IWP2）完全阻断类器官形成（图3E）；外源WNT5A可挽救IWP2的抑制效应（图3附图2B）。
• 在体验证：口服WNT抑制剂LGK-974降低垂体Axin2（WNT靶基因）表达，并减少SOX2⁺Ki67⁺细胞比例（图3F），证实WNT通路维持干细胞增殖。

4. 跨物种保守性：人类胎儿垂体的WNT特征

整合人类胎儿垂体scRNA-seq数据（Zhang et al., 2020），发现：

• 相似表达模式：WNT5A在干细胞与间质细胞中高表达，RSPO3富集于间质细胞（图3G）。
• 发育阶段对应：小鼠新生儿期（PD7）与人类胎儿晚期转录组高度重叠（图3附图2G），提示WNT通路在物种间保守。

五、新生儿垂体的高效再生能力与机制

1. 损伤模型的建立与再生表型

通过GhCre;ROSA26ⁱᴰᵀᴿ小鼠（生长激素细胞特异性消融模型）发现：

• 再生效率差异：新生儿垂体在2个月内完全恢复GH⁺细胞数量，而成年仅恢复50–60%（图4D）。
• 干细胞反应差异：损伤后新生儿干细胞未出现额外增殖（SOX2⁺Ki67⁺比例不变），而成年干细胞会显著活化（图4C）。

2. 再生机制的转录组解析

scRNA-seq分析损伤后垂体（PD7）：

• 激素前体细胞主导再生：Pou1f1⁺谱系前体细胞（Pou1f1 Lin Prog）增殖增强（图4E–F），且GH⁺细胞直接增殖（图4F右）。
• 干细胞分化贡献：SOX2⁺GH⁺细胞比例增加（图4G），提示干细胞向生长激素细胞分化。
• 信号通路变化：损伤未上调IL-6或WNT通路（图4附图1E），但NOTCH信号在干细胞中下调（图4附图2B），可能促进分化进程。

核心结论：新生儿垂体因干细胞已处于“预活化”状态，无需额外激活即可通过前体细胞增殖与干细胞分化高效再生。

六、讨论与展望：从发育机制到再生医学的转化

本研究首次系统解码了新生儿垂体干细胞的活化表型，其核心特征可概括为：

1. 表型特征：上皮-间质混合状态；
2. 分子机制：WNT通路主导的自我维持与旁分泌调控；
3. 功能输出：高效再生能力无需干细胞额外活化。

研究亮点：

• 技术整合：结合scRNA-seq、类器官、在体基因干预，多维度验证机制。
• 跨物种关联：小鼠新生儿与人类胎儿垂体的保守性提示临床转化潜力。
• 再生启示：阐明“预活化”干细胞在再生中的优势，为垂体损伤修复提供新策略（如WNT激动剂应用）。

未来方向：

• 探索WNT通路上游微环境信号（如间质细胞衍生因子）的时空调控；
• 解析IL-6家族因子的冗余机制在干细胞稳态中的作用；
• 开发靶向垂体干细胞的再生疗法，用于垂体功能减退症的治疗。

附图与表格索引

图表	内容概述
图1	单细胞转录组揭示新生儿垂体干细胞活化表型（含UMAP聚类、标志基因表达、混合表型验证）
图1附图2	增殖性干细胞与激素前体细胞的差异基因与GO分析
图2	类器官模型重现干细胞活化表型（培养基优化、旁分泌效应、IL-6作用）
图3	WNT通路在干细胞活化中的核心作用（配体-受体互作、功能抑制验证、跨物种保守性）
图4	新生儿垂体高效再生机制（损伤模型、再生效率、细胞来源解析）
附录1表1	垂体类器官培养基组分（PitOM vs. RSpECT）

 

图1. 新生儿垂体单细胞转录组分析揭示干细胞活化表型 (A) UMAP展示新生儿与成年垂体的细胞聚类；(B) 干细胞标志物表达模式；(C) 上皮/间质混合表型的转录组与免疫荧光证据。

 

图2. 新生儿垂体类器官模型建立与旁分泌功能验证 (A) 类器官培养流程；(B) RSpECT培养基提升形成效率；(D) 共培养激活成年干细胞增殖；(E) IL-6对类器官扩增的作用。

 

图3. WNT通路驱动干细胞活化的机制 (A) WNT相关基因在新生儿干细胞的富集；(B) GO通路富集分析；(E) WNT抑制剂阻断类器官形成；(G) 人胎儿垂体WNT基因表达保守性。

 

图4. 新生儿垂体高效再生能力解析 (C) 损伤后干细胞无额外增殖；(D) GH⁺细胞完全再生；(F) PIT1⁺前体细胞增殖驱动再生。