盛夏科研充电计划：外泌体研究要点与实验指南

外泌体（Exosome）

外泌体（Exosome）于1986年首次被发现，是一种直径约为30至100纳米的双层膜囊泡结构。机体内多种细胞类型，包括免疫细胞、干细胞、心血管细胞、网织红细胞、血小板、神经细胞以及肿瘤细胞等，均可主动分泌外泌体，且其广泛分布于外周血、尿液、唾液、乳汁、腹水、羊水等多种体液中。这些外泌体携带大量具有特定功能的生物分子，如蛋白质（包括细胞因子、生长因子）、功能性mRNA及miRNA等，参与细胞通讯、细胞迁移、血管新生促进以及抗肿瘤免疫等多种生理过程，并与多种疾病的发生发展密切相关。外泌体的特殊结构和功能特性，使其在疾病诊断生物标志物的开发以及治疗手段的研究中展现出巨大潜力，未来有望作为天然药物载体应用于临床治疗。

01 外泌体研究：血浆与血清的选择

在开展外泌体相关研究时，选择血浆还是血清作为研究样本，需要依据具体的研究目的而定。血清是血液凝固后收集的液体，其中缺乏纤维蛋白原和凝血因子，但含有大量凝血产物。在凝血过程中，血小板会释放大量外泌体，研究显示，血清中外泌体约有近五成源自此类额外分泌途径。

血浆是血液去除血细胞后的液体成分；而血清则是血浆进一步去除纤维蛋白原及凝血因子后的产物。

通常情况下，为了更准确地反映外泌体的原始状态，建议选择血浆作为研究样本。然而，在针对血小板相关疾病等特殊研究领域时，血清则因其富含血小板源性外泌体而成为更合适的样本选择。

02 外泌体分离方法选择

外泌体的分离纯化是研究中的关键环节，高纯度的外泌体对于后续实验的准确性具有决定性意义。目前常用的分离方法包括超速离心、免疫磁珠、超滤、沉淀法及商业试剂盒等：

1，超速离心法（差速离心） 超速离心法是外泌体纯化的常用技术，通过交替进行低速和高速离心，可有效分离出大小相近的囊泡颗粒。该方法因其操作简便且能获得较多囊泡而被广泛应用。然而，其耗时较长，回收率受转子类型影响而不稳定，且纯度可能不高。此外，反复离心可能对囊泡造成损伤，影响其质量。

2，密度梯度离心 在超速离心力作用下，蔗糖溶液形成从低到高的密度梯度。外泌体在密度为1.13-1.19g/ml的区域富集。此方法获得的外泌体纯度较高，但操作步骤繁琐，耗时较长。

3，超滤离心 利用外泌体的尺寸特点（约几十纳米），通过选择合适截留相对分子质量（MWCO）的超滤膜进行分离。超滤离心法简单高效，且能保持外泌体的生物活性，是一种新兴的提取方法。

4，磁珠免疫法 外泌体表面具有特异性标记物（如CD63、CD9蛋白），通过与包被有对应抗体的磁珠结合，实现外泌体的分离。该方法特异性高，操作简便，且能保持外泌体的形态完整，但效率较低，外泌体的生物活性易受pH和盐浓度影响，不利于后续实验。

5，PEG沉淀法 聚乙二醇（PEG）可与疏水性蛋白和脂质分子结合形成共沉淀，用于从血清等样本中收集外泌体。但该方法存在纯度和回收率低、杂蛋白多、颗粒不均一、产生难以去除的聚合物等问题，且可能导致外泌体受损，因此在发表文章时可能受到质疑。

03 外泌体提取试剂处理血浆体积要求？

1-2mL血浆足以进行后续的QPCR检测，而4mL血清或血浆则可用于RNA测序和蛋白质谱分析。

04如何验证提取的外泌体？

根据国际细胞外囊泡协会（MISEV）2014年发布的指南，外泌体鉴定需结合多种方法：通过Western Blot检测样品中是否存在外泌体特异性标志蛋白；利用透射电子显微镜观察外泌体的形态特征；采用纳米粒子追踪分析（NTA）等技术评估外泌体的群体特征，包括粒径分布和浓度。

05 提取的外泌体是否适用于细胞共培养实验？

提取的外泌体经粒径分析和透射电镜检测确认其纯度和形态后，若保持生物活性，可用于细胞共培养实验。

06 外泌体的保存方式？

纯化后的外泌体建议分装成50-100μL每份，并存放于-80℃冰箱中长期保存。

07 外泌体提取产量？

从2mL血清或血浆中提取的外泌体数量约为1×10⁸至1×10⁹个，可满足后续的透射电镜和Western Blot等分析需求。

08 BCA法测定的蛋白浓度范围？

使用BCA方法测定的蛋白浓度通常在2~4μg/μL之间。

09 外泌体的电镜特征？

在负染电镜下，外泌体应呈现典型的茶托状或大饼状形态，边缘可见一圈相对明亮的环。若观察到无膜结构的球形颗粒，可能为脂蛋白或其他蛋白聚集体。

10 超速离心提取外泌体时未见沉淀的原因？

未见明显沉淀可能有以下原因：

1）样本量不足：使用的细胞上清或血清体积过小，导致外泌体产量较低。

2）离心管材质问题：若使用不透明离心管，由于外泌体产量本身较少，难以直接观察到沉淀。此时可假设存在沉淀，继续后续操作。

3）离心转头类型：部分品牌离心机的角转管壁粘附性较差，离心结束后沉淀可能很快滑落。建议在离心结束后立即收集样本。

 

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