IRAK4（白细胞介素-1受体相关激酶4）是一种在先天免疫中起关键作用的丝氨酸/苏氨酸激酶，其异常激活与多种疾病的发生发展密切相关。IRAK4是IL-1R/TLR信号通路中的关键节点，其降解是唯一能完全阻断该通路的方法。关联Th1/Th2/Th17相关通路。目前，对于IRAK4成药性或无可厚非，只是适应症的选择问题。KT-485（SAR447971）是由Kymera Therapeutics开发的一种口服、高效且选择性的IRAK4降解剂，用于治疗免疫炎症性疾病。
一、KT-485作用机制
KT-485通过降解IRAK4蛋白发挥作用，IRAK4是先天免疫的主要调节因子，也是介导IL-1和Toll样受体信号传导的myddosome复合体的关键蛋白。通过降解IRAK4，能够同时影响其激酶和支架功能，从而实现更全面且更易耐受的抗炎效果。
图:KT-485信号原理图
二、KT-485优势
在临床前研究中，KT-485显示出比KT-474更高的选择性和效力，并且具有更好的安全性。这使得KT-485成为利用IRAK4降解潜力的最佳候选药物。
三、KT-485临床开发进展
1、临床试验：
赛诺菲已选择将KT-485推进至临床研究阶段，预计将于2026年进入1期临床试验。这一决定是基于KT-485在临床前研究中展现出的强大开发潜力。
2、合作与里程碑
赛诺菲与Kymera在2020年就IRAK4靶点达成了多项目战略合作协议。根据协议，Kymera在2025年第二季度获得了2000万美元的里程碑付款，未来还有资格获得高达9.75亿美元的潜在临床、监管和商业里程碑付款。
3、KT-485疾病领域
KT-485主要被开发用于治疗免疫炎症性疾病，这些疾病目前仍有显著的未满足需求。IRAK4在调节先天免疫和炎症信号传导中起关键作用。
四、IRAK4靶点相关疾病
1、自身免疫性疾病
系统性红斑狼疮（SLE）：IRAK4在SLE的发病机制中扮演重要角色。TLR2和TLR4信号通路的激活会导致促炎细胞因子如IL-6和TNF-α的释放以及自身抗体的产生，这些自身抗体可在多种组织中沉积，引发炎症和组织损伤。此外，TLR7/9信号通路在树突状细胞上的激活也参与了SLE的发病。动物模型研究显示，靶向IRAK4可减少SLE的疾病表现和症状。
类风湿性关节炎（RA）：IRAK4参与了RA的炎症和破坏过程。TLR信号通路在RA的发病机制中起重要作用，IRAK4作为该通路的关键激酶，其异常激活与RA的滑膜炎症和关节损伤密切相关。目前，一些IRAK4抑制剂如Zimlovisertib（PF-06650833）和Edecesertib（GS-5718）等正在RA治疗中进行临床试验。
干燥综合征（Sjogren's syndrome）：该疾病也与IL-1R/TLRs信号通路有关，IRAK4作为该通路的关键组分，其异常激活可能参与了干燥综合征的发病。
2、炎症性疾病
酒精性肝病（ALD）：乙醇可直接损伤肝细胞并触发炎症反应，导致肝损伤。IL-1R/TLRs信号通路参与了ALD的发展，酒精摄入后肠道通透性增加，导致TLR配体LPS在肝脏中积累，进而激活肝Kupffer细胞中的IL-1R/TLRs，招募MyD88和IRAKs家族成员形成复合体，诱导NF-κB激活，促进炎症因子的转录。研究发现，与正常肝组织相比，酒精性肝损伤患者的磷酸化IRAK4水平升高，而IRAK4抑制剂的给药可减轻乙醇诱导的肝损伤。
炎症性肠病（IBD）：包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，其发病机制涉及肠道黏膜的异常免疫反应。IRAK4在调节肠道炎症反应中起重要作用，其异常激活可能参与了IBD的发病。
银屑病：是一种慢性炎症性皮肤病，其发病机制涉及免疫细胞的异常激活和炎症因子的产生。IRAK4在TLRs信号通路中的作用与银屑病的发病密切相关，一些IRAK4抑制剂正在银屑病治疗中进行研究。
神经炎症性疾病：IRAK4在神经炎症中也发挥作用，其异常激活可能与神经炎症性疾病的发生发展有关。
3、肿瘤
血液系统恶性肿瘤：如活化型骨髓增生异常综合征（MDS）、B细胞弥漫大B细胞淋巴瘤（ABC-DLBCL）、慢性淋巴细胞白血病（CLL）和急性髓系白血病（AML）等。在ABC-DLBCL细胞中，MyD88的L265P突变可诱导MyD88与IRAK家族成员组成的myddosome复合体非依赖性寡聚化，导致IRAK4激活，进而诱导NF-κB激活进入细胞核，调节炎症因子的转录，促进B细胞的增殖和存活。在低危MDS中，TLRs的过表达/突变导致下游IRAK4过表达/过度激活，影响造血干细胞和祖细胞的功能，从而促进MDS的发展。
实体瘤：如结肠癌、乳腺癌和肺癌等。IRAK4的异常激活与这些肿瘤的发生发展有关，其通过调节肿瘤微环境中的炎症反应和免疫细胞的活性，促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。
4、其他疾病
特应性皮炎（AD）：是一种常见的慢性炎症性皮肤病，其发病机制涉及皮肤屏障功能障碍和免疫异常。IRAK4在TLRs信号通路中的作用与AD的发病密切相关，IRAK4降解剂KT-474曾在AD治疗中进入临床试验。
化脓性汗腺炎（HS）：是一种慢性、复发性、炎症性皮肤病，其发病机制尚不完全清楚，但免疫异常和炎症反应在其发病中起重要作用。IRAK4降解剂KT-474在HS治疗中也曾已进入临床试验阶段
五、PROTAC二/三元复合物检测
（一）CEBN和IRAK4蛋白（适合ELISA，TR-FRET和SPR等）
图左：The CRBN/DDB1 activity was detected using HTRF technology.The reaction was performed by incubating the varying concentration of lenalidomide,CRBN/DDB1protein, substrate and beads at 25℃ for 60 min, then reading ratio 665/620 with BMG.
图右：IRAK4 activity test
（二）CEBN二元复合物检测（TR-FRET CRBN binding KIT）
人Cereblon(CRBN)蛋白配体结合检测试剂盒采用均相时间分辨荧光技术（TR-FRET），可用于CRBN抑制剂或配体的结合检测和筛选，Eu标记的检测抗体特异识别结合Tag1-CRBN/DDB1蛋白，受体标记的沙利度胺与CRBN结合，使Eu和Ac靠近，外部光源激发供体与受体之间发生能量共振转移，检测665nm波长的信号强度即可测定CRBN/DDB1与Thalidomide-Ac的结合。反应体系中加入的CRBN配体或PROTAC竞争结合CEBN/DDB1，使信号降低，配体或PROTAC浓度升高，信号降低。该均相实验操作简单，无需洗涤步骤。
图：CRBN二元检测原理示意图
图左：CRBN标准品检测；图右：结合活性和抑制剂验证
（三）PROTAC三元复合物检测（PROTAC binding assay）
THUNDER TR-FRET技术检测PROTAC三元复合物结合，选择标记荧光供体Eu的 Anti-Tag1的抗体和标记荧光受体FR的Anti-Tag2的抗体，抗体分别识别并结合E3连接酶和靶蛋白，加入PROTAC后，一对检测抗体相互靠近，激发Eu产生FRET，能量传递给FR，即可检测到665nm荧光信号。信号强度与PROTAC结合能力成正比关系。抗体孵育仅需1小时，是检测蛋白蛋白相互作用的利器。
图：THUNDER 检测PROTAC三元复合物结合示意图
六、IRAK4蛋白降解检测（适合细胞内的IRAK4降解）
同样使用THUNDER TR-FRET技术检测细胞内的总IRAK4水平，THUNDER检测技术特异性好，灵敏度高，重复性好，通量高，操作简单，手动15min即可完成实验。下图是THUNDER原理示意图和操作流程。分别用THP-1和MCF-7细胞系，选择KT-474孵在37℃孵育24小时，分别检测信噪比和IC50。
图：THUNDER检测Total IRAK4原理及流程示意图。在THP-1和MCF-7细胞验证数据
七、下游信号通路检测（IL1R/TLR 信号通路检测）
（一）THUNDER TR-FRET方法（快速，免洗，高通量）
以Phospho-NF-κB为例
THUNDER采用经典的双抗夹心检测模型，特异性识别磷酸化位点来检测蛋白磷酸化水平，检测NF-κB磷酸化水平仅需4小时。
图：THUNDER检测p-NFkB原理流程示意图及检测数据
（二）WB方法
以Phospho-NF-κB为例
Phospho-NF-κB p65 (Ser536) 抗体采用1/1000稀释， HELA细胞100 ng/ml Calyculin A处理30分钟， TNF-α 20 ng/ml 处理5分钟，Goat Anti-rabbit IgG, (H+L), HRP 采用1/10000稀释，上样检测，数据展示如下。
图左：Hela细胞WB检测p-NFkB数据展示，图右：NIH3T3细胞WB检测p-NFkB数据展示
八、细胞因子检测（Biomarker检测）
（一）THUNDER TR-FRET方法（高通量，免洗，快速，上样量小）
以Human IL1β为例
THUNDER TR-FRET应用双抗夹心技术检测模型，一对特性抗体识别细胞因子后与其结合，用光（320~340nm）激发荧光供体产生FRET（615nm）信号进而激发荧光受体发射信号（665nm）。抗体孵育2小时，信号强度与IL1β浓度成正比。
THUNDER TR-FRET Human IL1β，Dynamic Range：32–10000pg/mL
（二）OneStep ELISA细胞因子检测
以Human IL6为例
OneStep ELISA开发标签抗体捕获技术，板底包被标签抗体，可高灵敏捕获双抗夹心复合物，搭配高特异性重组单抗，一步即可在溶液中形成抗体-分析物夹心复合物。可轻松准确定量蛋白。仅需1h，即可定量细胞因子。Human IL6 Range：2.1 pg/ml - 136 pg/ml。
图：OneStep ELISA检测原理及Human IL6 标准曲线
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