布鲁顿酪氨酸激酶（Bruton's Tyrosine Kinase，BTK）属于Tec家族激酶，主要存在于B细胞和髓样细胞中，是B细胞抗原受体（BCR）信号通路的关键调节因子，参与B细胞的发育、活化、增殖及分化等过程，其在多种疾病的发生发展中发挥着重要作用。
一、BTK相关通路
BTK在BCR信号通路中处于核心地位。当抗原与BCR结合后，引发BCR的寡聚化，激活Lyn、Syk等激酶，进而激活BTK。激活后的BTK与BLNK、Lyn、SYK等蛋白形成信号复合体，并磷酸化磷脂酶C（PLC）γ2，导致细胞内钙离子释放，通过细胞外信号调节激酶和NF-κB信号通路的传导，诱导基因表达的改变，从而促进B细胞的存活、增殖和分化。此外，BTK还参与 FcR、细胞因子、趋化因子等信号通路，在免疫调节中扮演着关键角色。
图、BTK在BCR信号通路中的示意图1
二、靶向BTK已上市药物
BTK抑制剂是一类针对布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）的药物。自从第一个BTK抑制剂伊布替尼于2013年上市以来，BTK抑制剂在血液瘤中得到了广泛应用，目前上市的BTK抑制剂主要分为以下几类：
（一）不可逆共价抑制剂
1、伊布替尼（Ibrutinib）：2013年首次获批，是第一代BTK抑制剂的代表药物，通过与BTK活性位点中的半胱氨酸残基（Cys481）形成共价键，不可逆地抑制BTK的活性，从而抑制肿瘤细胞的增殖和存活，在多种B细胞恶性肿瘤的治疗中取得了显著效果，如慢性淋巴细胞白血病（CLL）、小淋巴细胞淋巴瘤（SLL）、套细胞淋巴瘤（MCL）、华氏巨球蛋白血症（WM）等，还获批用于治疗慢性移植物抗宿主病（cGVHD）。
2、阿卡替尼（Acalabrutinib）：2017年获批，是一种第二代不可逆共价BTK抑制剂，对BTK的选择性较高，主要用于治疗CLL/SLL和MCL等疾病。
3、泽布替尼（Zanubrutinib）：2019年获批，也是第二代不可逆共价BTK抑制剂，具有较高的BTK选择性，在CLL/SLL、MCL、MZL、WM等多种B细胞恶性肿瘤中显示出良好的疗效。
4、替拉布替尼（Tirabrutinib）：2020年3月在日本获批用于治疗复发/难治性原发性中枢神经系统淋巴瘤（PCNSL），2021年3月在日本获批用于治疗华氏巨球蛋白血症（WM），2021年9月在日本获批用于治疗复发/难治性淋巴浆细胞淋巴瘤（LPL）
5、奥布替尼（Orelabrutinib）：2020年在中国获批，用于治疗复发/难治性套细胞淋巴瘤（MCL）、复发/难治性慢性淋巴细胞白血病（CLL）/小淋巴细胞淋巴瘤（SLL）。
（二） 可逆非共价抑制剂
匹托布鲁替尼（Pirtobrutinib）：2023年获批，是目前唯一上市的第三代BTK抑制剂，采用非共价结合机制，可与BTK的非活性构象结合，有望克服因BTK C481S突变而产生的耐药性问题，用于治疗既往接受过至少一种BTK抑制剂治疗的复发或难治性CLL/SLL、MCL成人患者。
（三）BTK降解剂
BGB-16673：是百济神州研发的PROTAC药物，通过招募E3泛素连接酶来诱导BTK蛋白降解，从源头上解决耐药蛋白累积的问题，早期临床数据令人瞩目，2025年5月已启动头对头挑战吡托布鲁替尼的III期研究。
三、BTK靶点在自免疾病潜力
BTK抑制剂目前在自身免疫性疾病领域全球尚未成药。奥布替尼在中枢神经系统和神经末梢周围对脱髓鞘疾病的治疗中能够发挥潜在效果。凭借高靶向选择性、安全性和血脑屏障（BBB）穿透能力，奥布替尼为治疗自身免疫性疾病提供了极具前景的治疗方案。
诺诚健华，奥布替尼在自免疾病治疗中，依据临床数据显示呈现出积极效果。
①多发性硬化（MS），奥布替尼治疗MS全球多中心II期临床数据分析显示，三个剂量组的 24 周数据都达到主要终点，每天一次80毫克剂量组显示了最优的有效性，并且在整个 24周内病灶控制效果最佳，安全性也最好，这表明每天一次80毫克有潜力成为治疗MS的最佳剂量。
②系统性红斑狼疮（SLE），奥布替尼治疗SLE的II期临床试验取得积极效果，疗效呈剂量依赖性的改善趋势。奥布替尼治疗SLE预计2024年完成患者入组。我们期待奥布替尼成为潜在治疗SLE的first-in-class BTK抑制剂。
注：以上信息来自诺诚健华官网
四、BTK靶点研究相关检测
（一）THUNDER TR-FRET磷酸化BTK /总BTK检测
THUNDER TR-FRET采用经典的双抗夹心检测模型检测Phospho-BTK和Total BTK水平，两个标记了荧光Eu和FR的抗体分别识别BTK不同表位，抗体结合到BTK后，荧光基团相互靠近，320nm激发后进而产生FRET（荧光共振能量转移），从而在665nm检测荧光信号值。THUNDER检测技术特异性好，灵敏度高，重复性好，通量高，操作简单，抗体孵育仅需4h，手动15min即可完成实验。
图、THUNDER BTK磷酸化检测原理及流程图
图：磷酸化BTK和total BTK在Raji细胞系中激动剂和抑制剂验证数据
（二）BTK激酶活性检测
ADP激酶活性检测，基于生物发光法的激酶/ATP酶活性检测系统，通过检测激酶反应中生成的ADP量来反映酶活性。
图：UA-GLO检测原理示意图
1、UA-GLO激酶活性检测试剂盒优势
① ATP浓度从1μM到1mM 都可以用于实验，可区分竞争性和非竞争性的激酶抑制剂
② 极高的灵敏度和更大的动态量程：低至0.25pmol的ADP可以被检测到
③ 信号稳定：荧光信号0.5-12hr内均可检测
④ 便捷的实验步骤
⑤ 适合于高通量检测
2、UA-GLO激酶活性检测试剂盒数据
检测化合物H-89 和PKI的EC50。ATP 竞争性化合物H8-9 和ATP 非竞争性化合物PKI是激酶PKA的抑制剂。两个化合物在三个ATP浓度:10/100/500μM 的条件下进行激酶反应之后用UA-Glo 激酶ADP检测试剂检测产生的ADP。化合物在不同ATP 浓度下的剂量-效果曲线和EC50结果见下图。ATP竞争性化合物H8-9的EC50随反应中ATP浓度增加而增大，而ATP非竞争性化合物PKI的EC50基本不受ATP浓度的影响。使用市场领先品牌PC对H8-9在同样实验条件，ATP 浓度10μM和100μM时测得EC50分别为65nM和567nM, 和UA-Glo激酶ADP检测试剂测得EC值一致。
检测化合物星形孢菌素对三种激酶的EC50。星形孢菌素（Staurosporine, STSP）为多种激酶的抑制剂。用UA-Glo 激酶ADP检测试剂检测了STSP在不同ATP浓度下对三种激酶(PKA, CDK2/CycE1, SRPK1)的EC50。STSP在不同ATP浓度下的剂量-效果曲线和EC50结果见下图，所得EC50和文献报道一致。
（三） BTK激酶
BTK Protein，GST tag
（四） BTK PROTAC研究E3连接酶
DDB1/CRBN Complex, His Tag Protein
图：The CRBN/DDB1 activity was detected using HTRF technology.The reaction was performed by incubating the varying concentration of lenalidomide,CRBN/DDB1protein, substrate and beads at 25℃ for 60 min, then reading ratio 665/620 with BMG.
（五）PROTAC三元复合物检测（PROTAC binding assay）
THUNDER TR-FRET技术检测PROTAC三元复合物结合，选择标记荧光供体Eu的 Anti-Tag1的抗体和标记荧光受体FR的Anti-Tag2的抗体，抗体分别识别并结合E3连接酶和靶蛋白，加入PROTAC后，一对检测抗体相互靠近，激发Eu产生FRET，能量传递给FR，即可检测到665nm荧光信号。信号强度与PROTAC结合能力成正比关系。抗体孵育仅需1小时，是检测蛋白蛋白相互作用的利器。
图：THUNDER 检测PROTAC三元复合物结合示意图
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| UA-Glo Kinase ADP Assay | UA070101 | 1000 pionts |
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