Messenger RNA expressing PfCSP induces functional, protective immune responses against malaria in mice

一、文献背景与研究意义

疟疾作为一种跨越人类历史的传染性疾病，至今仍是全球重大公共卫生威胁。据世界卫生组织（WHO）2019 年报告，2018 年全球疟疾临床病例达 2.28 亿例，死亡人数 40.5 万，其中恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）是导致发病率和死亡率最高的疟原虫种类。目前疟疾防控依赖媒介控制、抗疟药物及疫苗，但蚊虫抗药性和寄生虫药物抗性的蔓延，使得研发高效疫苗成为当务之急。

当前临床进展最领先的疟疾疫苗候选物 RTS,S/AS01，其保护效力仅为 30%~40%，且随时间衰减。该疫苗基于恶性疟原虫子孢子期主要表面抗原 —— 环子孢子蛋白（PfCSP）的 C 端片段及 18 个 NANP 重复序列，与乙肝表面抗原形成病毒样颗粒（VLP）。为突破传统疫苗的局限，研究人员转向新型疫苗技术，其中信使 RNA（mRNA）平台凭借精准抗原设计、不整合宿主基因组、同时激活体液与细胞免疫的优势，在新冠疫苗成功应用后，成为传染病疫苗研发的前沿方向。

本文（发表于npj Vaccines 2021 年，DOI: 10.1038/s41541-021-00345-0）以 PfCSP 为靶抗原，构建 PfCSP mRNA 疫苗，通过脂质纳米颗粒（LNP）递送，系统评估其在哺乳动物细胞中的表达效率、小鼠模型中的免疫原性及抗疟保护效果，探索剂量、免疫间隔、mRNA 修饰等因素对疫苗效力的影响，为疟疾 mRNA 疫苗研发提供关键数据支撑。

二、研究材料与方法解析

2.1 核心实验材料

2.1.1 PfCSP mRNA 设计与制备

研究采用两种 PfCSP mRNA（表 1），均基于恶性疟原虫 3D7 株 PfCSP 序列（NCBI 参考序列：XM_001351086.1），编码全长 PfCSP（含 N 端、38 个 NANP 重复区、C 端 α-TSR 区），但去除糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定序列以避免膜定位干扰。两种 mRNA 的关键差异在于核苷修饰、密码子优化及纯化方式，直接影响其稳定性与免疫原性。

表 1 PfCSP mRNA 的关键特性对比

2.1.2 脂质纳米颗粒（LNP）制剂

为解决 mRNA 体外易降解、细胞摄取效率低的问题，研究采用三种基于 Acuitas Therapeutics 专利脂质的 LNP 制剂（表 2），核心成分为可电离脂质（pKa 6.0~6.5）、DSPC、胆固醇、PEG - 脂质，通过自组装法封装 PfCSP mRNA（ aqueous 相 mRNA 与乙醇相脂质快速混合）。LNP 的理化特性直接影响 mRNA 递送效率，其中粒径、多分散指数（PDI）及包封率是关键指标。

表 2 三种 LNP 制剂的理化表征

2.1.3 细胞系与动物模型

细胞系：中国仓鼠卵巢细胞（CHO-E77.4），用于 mRNA 转染与 PfCSP 表达验证，培养于含 10% 胎牛血清、2mM L - 谷氨酰胺及青霉素 - 链霉素的 RPMI-1640 培养基中。

动物模型：5~6 周龄雌性 BALB/cJ 及 C57BL/6 小鼠，分别用于同源与异源疟原虫挑战实验。挑战用疟原虫为转基因伯氏疟原虫（Pb-PfCSP），包括表达恶性疟原虫 NF54/3D7 株 PfCSP 的 Pb (ANKA)-PfCSP（用于 BALB/c）及表达 Wellcome 株 PfCSP 的 Pb-PfCSP（用于 C57BL/6），子孢子从感染的斯氏按蚊唾液腺中提取。

2.2 关键检测方法

2.2.1 PfCSP 表达验证

免疫荧光染色：CHO 细胞转染 PfCSP mRNA 后 16h，用抗 PfCSP 单克隆抗体（2A10）与 FITC 标记二抗孵育，DAPI 染核，通过荧光显微镜观察 PfCSP 定位，计算 FITC/DAPI 荧光面积比量化表达水平。

Western blot：收集转染后 8、24、48h 的细胞沉淀（pellet）与上清（supernatant），经 SDS-PAGE 电泳后转印至硝酸纤维素膜，用兔抗 r-PfCSP 多克隆抗体检测，以 10ng 重组 PfCSP（r-PfCSP，分子量～33kDa，凝胶迁移～50kDa）为参照，ImageJ 软件分析条带密度。

2.2.2 免疫应答评估

体液免疫检测：

ELISA：包被 r-PfCSP、(NANP)₆重复肽或 α-TSR 肽，检测血清中特异性 IgG 滴度（定义为 OD₄₁₅=1 时的稀释度）、抗体亲和力（硫氰酸钠变性法计算亲和力指数）及 IgG 亚类（IgG1、IgG2a、IgG2b）。

肝期发育抑制实验（ILSDA）：将小鼠血清（1:40 稀释）与恶性疟原虫子孢子共孵育后感染人肝细胞，通过定量疟原虫 18S rRNA 计算子孢子入侵抑制率，评估抗体功能性。

细胞免疫检测：

ELISpot：分离免疫后小鼠脾细胞，用 PfCSP 重叠 15 肽库刺激，检测 IFN-γ 分泌细胞（斑点形成细胞，SFC）数量。

MSD 多因子检测：脾细胞刺激 48h 后，采用 Meso Scale Discovery 平台定量上清中 10 种细胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-12p70 等 Th1 因子；IL-4、IL-5 等 Th2 因子；IL-1β、IL-6 等促炎因子）。

2.2.3 保护效果评估

小鼠免疫后 2 周，静脉注射 1000 个 Pb-PfCSP 子孢子，于挑战后 7、8、10、11、14 天制作 Giemsa 染色薄血涂片，显微镜观察血期寄生虫。

三、核心研究结果解析

3.1 PfCSP mRNA 在哺乳动物细胞中的表达与定位

PfCSP 的有效表达是疫苗发挥作用的前提。研究通过免疫荧光与 Western blot 验证了 PfCSP mRNA 在 CHO 细胞中的表达特性（图 1）：

表达定位：免疫荧光显示，PfCSP 主要定位于细胞质（FITC 信号与 DAPI 核信号无重叠），阴性对照（仅转染试剂）无 FITC 信号；Western blot 结果表明，PfCSP 仅在细胞沉淀（pellet）中检测到，上清（supernatant）中未检测到（图 1B），证明 PfCSP 为细胞关联蛋白，即使含天然信号肽也不分泌，这一特性可避免抗原被体液稀释，增强抗原提呈效率。

表达动力学：Western blot 条带密度分析显示，PfCSP 表达在转染后 8~24h 达到峰值，48h 时蛋白水平显著下降（图 1B）；两种 mRNA-LNP（TriLink 与 UPenn）转染后 48h，均能在细胞沉淀中检测到 PfCSP，且 UPenn mRNA-LNP 的表达水平显著高于 TriLink（图 1C），提示核苷修饰可能提升 mRNA 的翻译效率或稳定性。

图 1 PfCSP mRNA 在 CHO 细胞中的表达与定位

A：免疫荧光染色结果（×630 magnification），左：DAPI 核染色（蓝色），中：PfCSP FITC 染色（绿色），右：叠加图；B：不同时间点（8h、24h、48h）CHO 细胞 pellet 与 supernatant 的 Western blot 分析，r-PfCSP（10ng）为参照，箭头指示 PfCSP 条带（~60kDa）；C：PfCSP mRNA-LNP（TriLink vs UPenn）转染 48h 后的 Western blot 对比，Boost+TransIT 为阳性对照。

3.2 PfCSP mRNA-LNP 平台的免疫原性分析

LNP 作为 mRNA 递送载体，同时发挥 “保护 mRNA + 佐剂” 双重功能。研究对比三种 LNP 制剂的免疫原性，发现 LNP1 在体液与细胞免疫诱导中表现最优（图 2、表 3）：

体液免疫应答：

IgG 滴度：两剂免疫（3 周间隔）后，LNP1 高剂量组（30μg）的 r-PfCSP 特异性 IgG 滴度（几何均值～10⁶）显著高于 LNP2 高剂量组（~10⁵），LNP3 组滴度最低（图 2A）；低剂量组（10μg）中，LNP1 的 IgG 滴度也显著高于 LNP2 与 LNP3。

抗体亲和力：LNP1 高剂量组的抗体亲和力指数（~80）显著高于 LNP2 高剂量组（~50）；有趣的是，LNP2 与 LNP3 的高剂量组亲和力指数反而低于低剂量组（图 2B），提示过高剂量可能导致抗体成熟不充分。

抗体功能性（ILSDA）：所有 LNP 组均能诱导子孢子入侵抑制，但 LNP1 效果最优 —— 低剂量组抑制率 98.1%，高剂量组 99.2%，显著高于 LNP2（最高 86.6%）与 LNP3（最高 84.9%）（图 2C），证明 LNP1 诱导的抗体具有强效抗子孢子活性。

细胞免疫应答：

Th1 型细胞因子占优：MSD 检测显示，LNP1 高剂量组的 Th1 型细胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-12p70）浓度显著高于 LNP2 与 LNP3（图 2D-G），其中 IFN-γ 浓度达 15000pg/mL 以上，是 LNP2 高剂量组的 2 倍；Th2 型细胞因子（IL-4、IL-5）浓度极低（<100pg/mL），提示 LNP1 诱导Th1 偏向的细胞免疫，这一免疫表型与抗胞内病原体（如疟原虫肝期）的保护机制一致。

促炎因子调节：LNP1 高剂量组的 IL-10（免疫调节因子）浓度显著高于其他组，IL-10 可通过抑制过度炎症反应，维持免疫应答的稳态，避免免疫病理损伤。

表 3 三种 LNP 制剂诱导的免疫应答关键指标（两剂免疫，3 周间隔）

图 2 不同 LNP 制剂诱导的免疫应答分析

A：r-PfCSP 特异性 IgG 滴度（几何均值 ±95% 置信区间）；B：抗体亲和力指数；C：ILSDA 子孢子入侵抑制率；D-G：MSD 检测的 Th1 型细胞因子浓度（IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-12p70）。每组 n=5 只小鼠，统计分析采用 Mann-Whitney 检验，*p<0.05，**p<0.01。

3.3 免疫程序对疫苗效力的影响

免疫程序（剂量、间隔、次数）是疫苗研发的关键参数，研究通过系列实验优化 PfCSP mRNA-LNP 的免疫方案（图 3）：

3.3.1 单剂量 vs 多剂量

单剂量（30μg PfCSP mRNA-LNP1）虽能诱导可检测的 IgG 应答，但滴度（~2×10⁵）显著低于两剂量组（10μg×2，3 周间隔，~8×10⁵）；

ILSDA 显示，单剂量组的抑制率（<20%）接近空白对照，而两剂量组达 98% 以上；

细胞免疫方面，单剂量组的 IFN-γ、TNF-α 浓度仅为两剂量组的 1/3~1/2，证明多剂量免疫是诱导功能性免疫应答的必要条件，这与 Zika 病毒 mRNA 疫苗的研究结果一致。

3.3.2 免疫间隔优化

3 周 vs4 周间隔（两剂量，10μg）：两组 IgG 滴度（~8×10⁵ vs ~9×10⁵）与细胞因子浓度无显著统计学差异，但 4 周间隔组的 ILSDA 抑制率（~99%）略高于 3 周组（~98%），提示较长间隔可能促进 B 细胞成熟；

3 周 vs6 周间隔（三剂量，10μg，UPenn mRNA）：6 周间隔组的保护率显著提升 ——BALB/c 小鼠中，UPenn mRNA-LNP1 6 周间隔组的无菌保护率达 88%，而 3 周间隔组仅 40%；同时，6 周间隔组诱导的抗体更偏向 NANP 重复区（NANP/α-TSR 抗体比值～3.0），而 3 周组为～1.5（图 3B）。已知 NANP 重复区是 PfCSP 的免疫优势表位，其抗体水平与抗疟保护直接相关，这解释了 6 周间隔组的高保护率。

3.3.3 免疫次数（两剂 vs 三剂）

三剂量（10μg×3，3 周间隔）与两剂量相比，r-PfCSP 与 NANP 重复区的 IgG 滴度提升约 2 倍，α-TSR 区抗体无显著变化；

IgG 亚类分析显示，两剂量组 IgG1 与 IgG2a 水平平衡（比值～1.0），三剂量组 IgG2a 显著升高（比值～1.5），提示第三剂量推动免疫应答向 Th1 偏向（IFN-γ 促进 IgG2a 生成）；

C57BL/6 小鼠中，三剂量 TriLink mRNA-LNP1 的保护率（27%）高于两剂量（20%），而 UPenn mRNA-LNP1 三剂量组保护率达 60%，进一步证明多剂量与核苷修饰的协同作用。

图 3 免疫程序对 PfCSP mRNA-LNP 免疫应答的影响

A：不同免疫剂量与次数的 IgG 滴度对比（左）与 ILSDA 抑制率（右）；B：3 周 vs6 周间隔（UPenn mRNA）的 NANP/α-TSR 抗体比值（左）与保护率（右）；C：两剂 vs 三剂免疫的 IgG 亚类比值（IgG2a/IgG1）。每组 n=10~15 只小鼠，统计分析采用 Kruskal-Wallis 检验，p<0.01，*p<0.001。

3.4 PfCSP mRNA-LNP 在小鼠中的抗疟保护效果

保护效果是疫苗的核心评价指标，研究在 BALB/c 与 C57BL/6 小鼠中验证了 PfCSP mRNA-LNP 的抗疟活性（图 4）：

3.4.1 BALB/c 小鼠（同源挑战）

挑战用疟原虫为 Pb (ANKA)-PfCSP（表达 NF54/3D7 株 PfCSP），与疫苗靶抗原同源；

LNP1 组中，高剂量（30μg×2）保护率 40%，低剂量（10μg×2）20%，显著高于 LNP 空白组（0%）（p=0.0387，Logrank 检验）；

UPenn mRNA-LNP1（核苷修饰）表现更优：三剂量 6 周间隔组保护率 88%，是 TriLink mRNA-LNP1（未修饰）同条件组（40%）的 2 倍以上，证明核苷修饰可显著提升疫苗保护效力。

3.4.2 C57BL/6 小鼠（异源挑战）

挑战用疟原虫为 Pb-PfCSP（表达 Wellcome 株 PfCSP），与疫苗靶抗原（3D7 株）同源性 94.21%（NCBI BLAST），模拟临床异源感染场景；

UPenn mRNA-LNP1 三剂量组保护率 60%，TriLink mRNA-LNP1 三剂量组 27%，两剂量组 20%；

ILSDA 显示，UPenn 组血清抑制率（95.9%）显著高于 TriLink 组（79.3%），且与保护率呈正相关，证明功能性抗体是保护的关键介质。

图 4 PfCSP mRNA-LNP 在小鼠中的抗疟保护效果

A：BALB/c 小鼠（同源挑战）的 Kaplan-Meier 生存曲线，LNP1 高剂量组（30μg×2）保护率 40%；B：BALB/c 小鼠中 UPenn vs TriLink mRNA-LNP1（三剂量，6 周间隔）的保护率对比；C：C57BL/6 小鼠（异源挑战）的保护率与 ILSDA 抑制率相关性。每组 n=10~15 只小鼠，统计分析采用 Logrank 检验，*p<0.05，***p<0.001。

3.5 抗体特异性与 IgG 亚类分析

抗体的特异性与亚型直接影响其功能，研究通过精细 ELISA 解析了 PfCSP mRNA-LNP 诱导的抗体特性：

抗体特异性：所有免疫组均能诱导针对 r-PfCSP、NANP 重复区及 α-TSR 区的抗体，但存在剂量依赖性 —— 高剂量组（30μg）针对 r-PfCSP 与 NANP 的抗体滴度显著高于低剂量组（10μg），而 α-TSR 区抗体无显著剂量差异（图 5A）；6 周间隔组的 NANP/α-TSR 比值最高（~3.0），进一步证实 NANP 重复区抗体与保护的关联性。

IgG 亚类平衡：

两剂量组：IgG1 与 IgG2a 水平接近（滴度均～10⁶），IgG2b 水平较低（~10⁵），呈现Th1/Th2 平衡的免疫表型；

三剂量组：IgG2a 水平显著升高（~1.5×10⁶），IgG1 维持不变（~10⁶），IgG2a/IgG1 比值达 1.5，呈现 Th1 偏向；

这种亚类转换可能由 Th1 细胞因子（如 IFN-γ）驱动，而 Th1 偏向的免疫应答更有利于清除疟原虫肝期感染。

四、研究讨论与科学意义

4.1 mRNA-LNP 平台在疟疾疫苗中的核心优势

高效抗原表达与递送：本文证实，PfCSP mRNA 在 LNP 保护下可在哺乳动物细胞中高效表达，且为细胞关联蛋白，能增强抗原提呈细胞（APC）的摄取与提呈；LNP 的可电离脂质在酸性内体中质子化，促进 mRNA 逃逸至细胞质，同时激活固有免疫（如 TLR 通路），发挥佐剂效应，这一 “递送 + 佐剂” 双重功能是传统疫苗（如 RTS,S）无法比拟的。

免疫应答的可调控性：通过优化免疫程序（剂量、间隔、次数）与 mRNA 修饰（核苷修饰），可实现免疫应答的精准调控 —— 如两剂量诱导平衡免疫，三剂量推动 Th1 偏向，6 周间隔增强 NANP 抗体应答，为后续临床方案设计提供依据。

快速迭代潜力：mRNA 疫苗的制备无需体外表达蛋白，仅需修改序列即可针对不同疟原虫株（如 PfCSP 变异株）设计疫苗，应对疟疾流行株的多样性，这在突发公共卫生事件中具有显著优势。

4.2 关键发现的科学价值

NANP 重复区抗体的保护关联：研究首次在 mRNA 疫苗中证实，针对 PfCSP NANP 重复区的抗体水平与抗疟保护率正相关，且 6 周间隔组的 NANP/α-TSR 比值最高，保护率达 88%，这为疫苗抗原设计提供了靶点 —— 未来可通过增强 NANP 重复区的免疫原性（如增加重复次数）进一步提升保护效力。

核苷修饰的增效机制：UPenn mRNA（核苷修饰）的保护率显著高于 TriLink mRNA（未修饰），可能源于核苷修饰（1 - 甲基假尿苷）降低了 mRNA 的固有免疫原性（避免激活 TLR7/8），延长其半衰期，提升翻译效率；同时，纤维素纯化减少了双链 RNA（dsRNA）杂质，进一步降低炎症反应，维持免疫应答稳态。

免疫程序的优化方向：单剂量无法诱导功能性保护，两剂量为基础，三剂量可增强 Th1 偏向，6 周间隔优于 3 周，这一结果提示，临床研究中可探索 “两剂基础免疫 + 一剂加强” 的程序，且加强间隔可延长至 6 周，降低接种负担。

4.3 研究局限性与未来方向

动物模型的局限性：本文采用小鼠模型，虽能模拟疟原虫感染与免疫应答，但小鼠与人类的免疫系统及疟原虫感染动力学存在差异；未来需在非人灵长类（如恒河猴）模型中验证疫苗效力，评估长期保护效果。

保护机制的深入探索：本文证实功能性抗体与 Th1 细胞因子的重要性，但细胞免疫（如 CD8⁺ T 细胞）在肝期感染清除中的具体作用尚未明确；需通过 CD8⁺ T 细胞耗竭实验或 MHC I 类分子敲除小鼠，进一步解析细胞免疫的保护贡献。

疫苗的广谱性：本文仅评估了针对 3D7 株与 Wellcome 株 PfCSP 的保护效果，而全球疟疾流行区存在多种 PfCSP 变异株；未来需设计多表位 mRNA 疫苗，覆盖主要变异株的 NANP 重复区与保守 α-TSR 区，提升疫苗的广谱性。

五、研究总结

本文系统评估了表达 PfCSP 的 mRNA-LNP 疫苗在小鼠模型中的表达效率、免疫原性及抗疟保护效果，核心结论如下：

PfCSP mRNA 在 LNP 递送下可在哺乳动物细胞中高效表达，且为细胞关联蛋白，增强抗原提呈；

LNP1 制剂诱导最优的体液与细胞免疫应答，产生的抗体可强效抑制子孢子入侵肝细胞（ILSDA 抑制率 > 98%），且 Th1 型细胞因子占优；

免疫程序显著影响疫苗效力：多剂量（两剂以上）、较长间隔（6 周）、核苷修饰 mRNA 可显著提升保护率，最高达 88%（BALB/c 小鼠）；

针对 PfCSP NANP 重复区的抗体与保护率正相关，三剂量免疫可推动 IgG 亚类向 Th1 偏向转换，增强抗肝期感染能力。

本研究为疟疾 mRNA 疫苗研发提供了关键数据支撑，证实 mRNA-LNP 平台是开发高效疟疾疫苗的可行策略，为后续非人灵长类实验与临床研究奠定了基础。

文献解析|表达 PfCSP 的信使 RNA 诱导小鼠产生抗疟疾的功能性保护免疫应答

Messenger RNA expressing PfCSP induces functional, protective immune responses against malaria in mice

一、文献背景与研究意义

二、研究材料与方法解析

2.1 核心实验材料

2.1.1 PfCSP mRNA 设计与制备

表 1 PfCSP mRNA 的关键特性对比

2.1.2 脂质纳米颗粒（LNP）制剂

表 2 三种 LNP 制剂的理化表征

2.1.3 细胞系与动物模型

细胞系：中国仓鼠卵巢细胞（CHO-E77.4），用于 mRNA 转染与 PfCSP 表达验证，培养于含 10% 胎牛血清、2mM L - 谷氨酰胺及青霉素 - 链霉素的 RPMI-1640 培养基中 。

2.2 关键检测方法

2.2.1 PfCSP 表达验证

免疫荧光染色：CHO 细胞转染 PfCSP mRNA 后 16h，用抗 PfCSP 单克隆抗体（2A10）与 FITC 标记二抗孵育，DAPI 染核，通过荧光显微镜观察 PfCSP 定位，计算 FITC/DAPI 荧光面积比量化表达水平。

2.2.2 免疫应答评估

体液免疫检测：

ELISA：包被 r-PfCSP、(NANP)₆重复肽或 α-TSR 肽，检测血清中特异性 IgG 滴度（定义为 OD₄₁₅=1 时的稀释度）、抗体亲和力（硫氰酸钠变性法计算亲和力指数）及 IgG 亚类（IgG1、IgG2a、IgG2b）。

肝期发育抑制实验（ILSDA）：将小鼠血清（1:40 稀释）与恶性疟原虫子孢子共孵育后感染人肝细胞，通过定量疟原虫 18S rRNA 计算子孢子入侵抑制率，评估抗体功能性。

细胞免疫检测：

ELISpot：分离免疫后小鼠脾细胞，用 PfCSP 重叠 15 肽库刺激，检测 IFN-γ 分泌细胞（斑点形成细胞，SFC）数量。

MSD 多因子检测：脾细胞刺激 48h 后，采用 Meso Scale Discovery 平台定量上清中 10 种细胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-12p70 等 Th1 因子；IL-4、IL-5 等 Th2 因子；IL-1β、IL-6 等促炎因子）。

2.2.3 保护效果评估

小鼠免疫后 2 周，静脉注射 1000 个 Pb-PfCSP 子孢子，于挑战后 7、8、10、11、14 天制作 Giemsa 染色薄血涂片，显微镜观察血期寄生虫。

三、核心研究结果解析

3.1 PfCSP mRNA 在哺乳动物细胞中的表达与定位

PfCSP 的有效表达是疫苗发挥作用的前提。研究通过免疫荧光与 Western blot 验证了 PfCSP mRNA 在 CHO 细胞中的表达特性（图 1）：

图 1 PfCSP mRNA 在 CHO 细胞中的表达与定位

3.2 PfCSP mRNA-LNP 平台的免疫原性分析

LNP 作为 mRNA 递送载体，同时发挥 “保护 mRNA + 佐剂” 双重功能。研究对比三种 LNP 制剂的免疫原性，发现 LNP1 在体液与细胞免疫诱导中表现最优（图 2、表 3）：

体液免疫应答：

IgG 滴度：两剂免疫（3 周间隔）后，LNP1 高剂量组（30μg）的 r-PfCSP 特异性 IgG 滴度（几何均值～10⁶）显著高于 LNP2 高剂量组（~10⁵），LNP3 组滴度最低（图 2A）；低剂量组（10μg）中，LNP1 的 IgG 滴度也显著高于 LNP2 与 LNP3。

抗体亲和力：LNP1 高剂量组的抗体亲和力指数（~80）显著高于 LNP2 高剂量组（~50）；有趣的是，LNP2 与 LNP3 的高剂量组亲和力指数反而低于低剂量组（图 2B），提示过高剂量可能导致抗体成熟不充分。

抗体功能性（ILSDA）：所有 LNP 组均能诱导子孢子入侵抑制，但 LNP1 效果最优 —— 低剂量组抑制率 98.1%，高剂量组 99.2%，显著高于 LNP2（最高 86.6%）与 LNP3（最高 84.9%）（图 2C），证明 LNP1 诱导的抗体具有强效抗子孢子活性。

细胞免疫应答：

促炎因子调节：LNP1 高剂量组的 IL-10（免疫调节因子）浓度显著高于其他组，IL-10 可通过抑制过度炎症反应，维持免疫应答的稳态，避免免疫病理损伤 。

表 3 三种 LNP 制剂诱导的免疫应答关键指标（两剂免疫，3 周间隔）

图 2 不同 LNP 制剂诱导的免疫应答分析

3.3 免疫程序对疫苗效力的影响

免疫程序（剂量、间隔、次数）是疫苗研发的关键参数，研究通过系列实验优化 PfCSP mRNA-LNP 的免疫方案（图 3）：

3.3.1 单剂量 vs 多剂量

单剂量（30μg PfCSP mRNA-LNP1）虽能诱导可检测的 IgG 应答，但滴度（~2×10⁵）显著低于两剂量组（10μg×2，3 周间隔，~8×10⁵）；

ILSDA 显示，单剂量组的抑制率（<20%）接近空白对照，而两剂量组达 98% 以上；

细胞免疫方面，单剂量组的 IFN-γ、TNF-α 浓度仅为两剂量组的 1/3~1/2，证明多剂量免疫是诱导功能性免疫应答的必要条件，这与 Zika 病毒 mRNA 疫苗的研究结果一致。

3.3.2 免疫间隔优化

3 周 vs4 周间隔（两剂量，10μg）：两组 IgG 滴度（~8×10⁵ vs ~9×10⁵）与细胞因子浓度无显著统计学差异，但 4 周间隔组的 ILSDA 抑制率（~99%）略高于 3 周组（~98%），提示较长间隔可能促进 B 细胞成熟；

3.3.3 免疫次数（两剂 vs 三剂）

三剂量（10μg×3，3 周间隔）与两剂量相比，r-PfCSP 与 NANP 重复区的 IgG 滴度提升约 2 倍，α-TSR 区抗体无显著变化；

IgG 亚类分析显示，两剂量组 IgG1 与 IgG2a 水平平衡（比值～1.0），三剂量组 IgG2a 显著升高（比值～1.5），提示第三剂量推动免疫应答向 Th1 偏向（IFN-γ 促进 IgG2a 生成 ）；

C57BL/6 小鼠中，三剂量 TriLink mRNA-LNP1 的保护率（27%）高于两剂量（20%），而 UPenn mRNA-LNP1 三剂量组保护率达 60%，进一步证明多剂量与核苷修饰的协同作用。

图 3 免疫程序对 PfCSP mRNA-LNP 免疫应答的影响

3.4 PfCSP mRNA-LNP 在小鼠中的抗疟保护效果

保护效果是疫苗的核心评价指标，研究在 BALB/c 与 C57BL/6 小鼠中验证了 PfCSP mRNA-LNP 的抗疟活性（图 4）：

3.4.1 BALB/c 小鼠（同源挑战）

挑战用疟原虫为 Pb (ANKA)-PfCSP（表达 NF54/3D7 株 PfCSP），与疫苗靶抗原同源；

LNP1 组中，高剂量（30μg×2）保护率 40%，低剂量（10μg×2）20%，显著高于 LNP 空白组（0%）（p=0.0387，Logrank 检验）；

UPenn mRNA-LNP1（核苷修饰）表现更优：三剂量 6 周间隔组保护率 88%，是 TriLink mRNA-LNP1（未修饰）同条件组（40%）的 2 倍以上，证明核苷修饰可显著提升疫苗保护效力。

3.4.2 C57BL/6 小鼠（异源挑战）

挑战用疟原虫为 Pb-PfCSP（表达 Wellcome 株 PfCSP），与疫苗靶抗原（3D7 株）同源性 94.21%（NCBI BLAST），模拟临床异源感染场景；

UPenn mRNA-LNP1 三剂量组保护率 60%，TriLink mRNA-LNP1 三剂量组 27%，两剂量组 20%；

ILSDA 显示，UPenn 组血清抑制率（95.9%）显著高于 TriLink 组（79.3%），且与保护率呈正相关，证明功能性抗体是保护的关键介质。

图 4 PfCSP mRNA-LNP 在小鼠中的抗疟保护效果

3.5 抗体特异性与 IgG 亚类分析

抗体的特异性与亚型直接影响其功能，研究通过精细 ELISA 解析了 PfCSP mRNA-LNP 诱导的抗体特性：

IgG 亚类平衡：

两剂量组：IgG1 与 IgG2a 水平接近（滴度均～10⁶），IgG2b 水平较低（~10⁵），呈现Th1/Th2 平衡的免疫表型；

三剂量组：IgG2a 水平显著升高（~1.5×10⁶），IgG1 维持不变（~10⁶），IgG2a/IgG1 比值达 1.5，呈现 Th1 偏向；

这种亚类转换可能由 Th1 细胞因子（如 IFN-γ）驱动，而 Th1 偏向的免疫应答更有利于清除疟原虫肝期感染。

四、研究讨论与科学意义

4.1 mRNA-LNP 平台在疟疾疫苗中的核心优势

快速迭代潜力：mRNA 疫苗的制备无需体外表达蛋白，仅需修改序列即可针对不同疟原虫株（如 PfCSP 变异株）设计疫苗，应对疟疾流行株的多样性，这在突发公共卫生事件中具有显著优势。

4.2 关键发现的科学价值

4.3 研究局限性与未来方向

动物模型的局限性：本文采用小鼠模型，虽能模拟疟原虫感染与免疫应答，但小鼠与人类的免疫系统及疟原虫感染动力学存在差异；未来需在非人灵长类（如恒河猴）模型中验证疫苗效力，评估长期保护效果。

疫苗的广谱性：本文仅评估了针对 3D7 株与 Wellcome 株 PfCSP 的保护效果，而全球疟疾流行区存在多种 PfCSP 变异株；未来需设计多表位 mRNA 疫苗，覆盖主要变异株的 NANP 重复区与保守 α-TSR 区，提升疫苗的广谱性。

五、研究总结

本文系统评估了表达 PfCSP 的 mRNA-LNP 疫苗在小鼠模型中的表达效率、免疫原性及抗疟保护效果，核心结论如下：

PfCSP mRNA 在 LNP 递送下可在哺乳动物细胞中高效表达，且为细胞关联蛋白，增强抗原提呈；

LNP1 制剂诱导最优的体液与细胞免疫应答，产生的抗体可强效抑制子孢子入侵肝细胞（ILSDA 抑制率 > 98%），且 Th1 型细胞因子占优；

免疫程序显著影响疫苗效力：多剂量（两剂以上）、较长间隔（6 周）、核苷修饰 mRNA 可显著提升保护率，最高达 88%（BALB/c 小鼠）；

针对 PfCSP NANP 重复区的抗体与保护率正相关，三剂量免疫可推动 IgG 亚类向 Th1 偏向转换，增强抗肝期感染能力。

细胞系：中国仓鼠卵巢细胞（CHO-E77.4），用于 mRNA 转染与 PfCSP 表达验证，培养于含 10% 胎牛血清、2mM L - 谷氨酰胺及青霉素 - 链霉素的 RPMI-1640 培养基中。

促炎因子调节：LNP1 高剂量组的 IL-10（免疫调节因子）浓度显著高于其他组，IL-10 可通过抑制过度炎症反应，维持免疫应答的稳态，避免免疫病理损伤。

IgG 亚类分析显示，两剂量组 IgG1 与 IgG2a 水平平衡（比值～1.0），三剂量组 IgG2a 显著升高（比值～1.5），提示第三剂量推动免疫应答向 Th1 偏向（IFN-γ 促进 IgG2a 生成）；