Reverse Transcriptase II

Reverse Transcriptase II 是对M-MuLV（RNase H-）进行基因工程改造，表达并纯化的高温逆转录酶，比M-MuLV（RNase H-）提高了热稳定性。该酶可以在高温条件下（50～60℃）进行cDNA第一链的合成，高温条件下有利于打开复杂RNA模板链。该酶最佳反应温度为50℃，具有热稳定相强，灵敏度高，特异性高，聚合能力强等优点。
产品组分：

实验方法：

cDNA 第一链合成反应体系：

试剂融化后，将试剂盒中各组分混匀并稍微离心后置于冰上。

（1） 按顺序加入以下反应物

（2）可选优化步骤：如果RNA模板GC含量高或含有二级结构，可先将模板与引物的混合液轻轻混匀，短暂离心，65°C 孵育5min，冰上冷却。

（3）轻轻混匀，离心。

（4）如果使用Oligo(dT)18或者基因特异型引物，50°C 孵育15-30min。 使用随机六聚体引物时，25°C，先孵育5min，随后50 °C 孵育15-30min。对于高GC含量或者具有复杂二级结构的RNA模板，使用60℃孵育 15-30min。

（5）70°C 加热5min终止反应。反应产物可直接用于 PCR 反应，如果不立即使用，-20°C 保存少于一周的时间。长时间保存建议-70°C 放置。

第一链 cDNA 的 PCR 扩增：

合成的第一链cDNA可直接用于PCR。

常用反应体系（50μl）

*Mg2+终浓度为 2mM

常用 PCR 循环

质量保证：

经多次柱纯化，SDS-PAGE 胶检测仅可见清晰单一目的条带。PCR 方法检测无大肠杆菌 DNA 残留，无核酸内、外切酶污染，无 RNA 酶污染。

活性定义：

以 Poly(rA)•Oligo（dT）为模板/引物，在 50℃、10 分钟条件下，掺入 1 nmol 的[3H] dTTP 所需要的酶量定义为 1 个活性单位。