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对比
咨询Reverse Transcriptase II 是对M-MuLV（RNase H-）进行基因工程改造，表达并纯化的高温逆转录酶，比M-MuLV（RNase H-）提高了热稳定性。该酶可以在高温条件下（50～60℃）进行cDNA第一链的合成，高温条件下有利于打开复杂RNA模板链。该酶最佳反应温度为50℃，具有热稳定相强，灵敏度高，特异性高，聚合能力强等优点。
产品组分：
产品组成 | 体积 |
Reverse Transcriptase II（200 U/ul） | 50ul |
5× RT Buffer II | 1ml |
实验方法：
cDNA 第一链合成反应体系：
试剂融化后，将试剂盒中各组分混匀并稍微离心后置于冰上。
（1） 按顺序加入以下反应物
模板RNA | 总RNA(0.1 ng -5ug) |
poly(A) mRNA(10 pg) | |
特异性RNA(0.01 pg) | |
引物 | Oligo (dT)18 1 ul |
Random N6 1 ul | |
基因特异性引物15-20 pmol | |
5× RT Buffer II | 4 ul |
RNase Inhibitor(40 U/μl) | 1 ul |
dNTPs（10 mM） | 2 ul |
Reverse Transcriptase II | 1 ul |
RNase Free Water | 至20ul |
（2）可选优化步骤：如果RNA模板GC含量高或含有二级结构，可先将模板与引物的混合液轻轻混匀，短暂离心，65°C 孵育5min，冰上冷却。
（3）轻轻混匀，离心。
（4）如果使用Oligo(dT)18或者基因特异型引物，50°C 孵育15-30min。 使用随机六聚体引物时，25°C，先孵育5min，随后50 °C 孵育15-30min。对于高GC含量或者具有复杂二级结构的RNA模板，使用60℃孵育 15-30min。
（5）70°C 加热5min终止反应。反应产物可直接用于 PCR 反应，如果不立即使用，-20°C 保存少于一周的时间。长时间保存建议-70°C 放置。
第一链 cDNA 的 PCR 扩增：
合成的第一链cDNA可直接用于PCR。
常用反应体系（50μl）
2×Taq Master Mix* | 25ul |
上游引物 | 0.2-1.0uM（终浓度） |
下游引物 | 0.2-1.0uM（终浓度） |
模板 | 1-50ng（质粒） 10ng-1ug（基因组） |
ddH2O | 至50ul |
*Mg2+终浓度为 2mM
常用 PCR 循环
94℃ | 1 分钟 30 秒 |
30 次循环 | 94℃，20 秒 |
57℃，20 秒 | |
72℃，1kb/60 秒 | |
72℃ | 5 分钟 |
4℃ | 保温 |
质量保证：
经多次柱纯化，SDS-PAGE 胶检测仅可见清晰单一目的条带。PCR 方法检测无大肠杆菌 DNA 残留，无核酸内、外切酶污染，无 RNA 酶污染。
活性定义：
以 Poly(rA)•Oligo（dT）为模板/引物，在 50℃、10 分钟条件下，掺入 1 nmol 的[3H] dTTP 所需要的酶量定义为 1 个活性单位。