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对比
咨询本制品是通过基因重组技术克隆表达M-MuLV的缺失突变型RNase H-的反转录酶。一般的野生型M-MuLV（Moloney Murine Leukemia Virus）具有以下几种活性：依赖于RNA的DNA聚合酶活性；依赖于DNA的DNA聚合酶活性；RNase H活性。由于RNaseH能够催化降解 DNA/RNA杂合体中的RNA，因此在cDNA第一条链的合成反应中可能会降解RNA/DNA杂合体中的模板RNA。本酶的RNase H活性缺失，延伸能力强，可用于较长的cDNA合成，高比例的全长cDNA文库的构建以及Real Time RT-PCR反应等。
产品组分：
| 组分名称 | 体积（10000U） |
Reverse Transcriptase（200 U/μl） | 50ul |
5×RT Buffer | 1ml |
实验方法：
cDNA 第一链合成反应体系：
试剂融化后，将试剂盒中各组分混匀并稍微离心后置于冰上。
1) 按顺序加入以下反应物
模板RNA | 总RNA(0.1 ng -5μg) |
poly(A) mRNA(10 pg) | |
特异性RNA(0.01 pg) | |
引物 | Oligo (dT)18 1 μl |
Random N6 1 μl | |
基因特异性引物15-20 pmol | |
5×RT Buffer | 4 ul |
RNase Inhibitor(40 U/μl) | 1 ul |
dNTPs（10 mM） | 2 ul |
Reverse Transcriptase | 1 ul |
RNase Free Water | 至20ul |
2) 如果RNA模板GC含量高或者含有二级结构，可先将RNA模板和RNase Free Water混匀后，65°C 孵育5分钟，冰上冷却，再加入其它组分。
3) 轻轻混匀，离心。42°C 孵育15-30分钟。如果RNA模板中不含poly A结构，25°C 先孵育5分钟，随后42°C 孵育15-30分钟。反应产物可直接用于 PCR，如果不立即使用， -20°C 保存少于一周，长时间保存建议-70°C放置。
注：有实验结果提示，本反转录酶可在 15 分钟内完成 1kb 反转录反应。
第一链 cDNA 的 PCR 扩增：
合成的第一链cDNA可直接用于PCR。
常用反应体系（50μl）
2×Taq Master Mix* | 25ul |
上游引物 | 0.2-1.0uM（终浓度） |
下游引物 | 0.2-1.0uM（终浓度） |
模板 | 1-2ul |
ddH2O | 至50ul |
*Mg2+终浓度为 2mM
常用 PCR 循环：
94℃ | 1 分钟 30 秒 |
30 次循环： | 94℃，20 秒 |
57℃，20 秒 | |
72℃，1kb/60 秒 | |
72℃ | 5 分钟 |
4℃ | 保温 |
2、确保所用试剂及超纯水中无RNA酶污染。
3、试剂盒要严格密封保存。在反转录过程中，所有管子确保扣严。
4、纯化过的RNA必须保证不含有盐，金属离子，乙醇和苯酚，以上成分会干扰第一链cDNA的合成反应。可采用乙醇沉淀RNA的方法去除掉痕量污染物。
5、为保证反转录反应的有效进行，需使用高质量的RNA模板。
质量保证：经多次柱纯化，SDS-PAGE 胶检测仅可见清晰单一目的条带，PCR 方法检测无大肠杆菌 DNA 残留，无核酸内、外切酶污染，无 RNA 酶污染。
活性定义：以Poly(rA)•Oligo（dT）为模板/引物，在37℃、10分钟条件下， 掺入1 nmol的[3H] dTTP所需要的酶量定义为1个活性单位。