背景介绍
肿瘤微环境中免疫细胞复杂的合成和分解代谢对于免疫细胞产生免疫应答能力是至关重要的。为了维持巨大的合成代谢需求，肿瘤细胞采用一种特殊的代谢方式使得肿瘤微环境通常是酸性、缺氧、缺乏营养物质、积累免疫抑制性代谢物。
这种微环境利于肿瘤细胞的生存和增殖，但不利于免疫细胞的生存和抗肿瘤效应。如何控制肿瘤和免疫细胞的代谢，如糖类、脂肪酸、氨基酸等代谢途径的变化，对于提高免疫细胞的抗肿瘤效应具有重要的意义。
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Met-Flow 是一种基于流式细胞术的检测免疫细胞代谢的新方法，通过靶向细胞多个代谢途径中的关键蛋白或限速酶，既可以对免疫细胞进行精准分群，又能同时检测这些细胞亚群在免疫应答过程中代谢状态的变化。
Met-Flow能够测量健康人外周血单个核细胞（PBMC）之间不同的代谢状态，并得出细胞的代谢概况与其子集表型，激活状态和免疫功能之间的关联。Met-Flow具有在单细胞水平上捕获代谢异质性的能力，可为了解跨任何细胞类型的代谢状态提供重要见解。
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Met-Flow的流式解决方案
2020年6月12号，来自新加坡的研究小组在Communications Biology上发表了一篇能够在单细胞、蛋白水平上检测不同免疫细胞代谢状态的新方法Met-Flow。Met-Flow通过检测10种关键代谢蛋白了解不同免疫细胞亚群的代谢状态。而传统的代谢分析方法均无法在单细胞、蛋白水平上同时检测不同免疫细胞亚群的代谢状态，如氧化还原态检测、微流体检测乳酸产物等单模态分析方法。所以，这些缺陷限制了传统代谢分析方法在不同免疫细胞亚群代谢状态研究中的应用。本文使用了BD FACSymphony™多参数流式细胞仪，通过Met-Flow方法在单细胞、蛋白水平上同时分析了不同免疫细胞亚群代谢状态的区别。
Panel设计如下
| Metabolic protein | |||
| Antigen | Clone | Fluorochrome | Provider |
| SLC20A1 | EPR11427 | BD AF647 | Customized |
| ACAC | clone EPR4971 | BD BUV496 | Customized |
| HK1 | EPR10134 | BD BUV661 | Customized |
| CPT1A | 8F6AE9 | BD V450 | Customized |
| IDH2 | EPR7577 | BD BB790 | Customized |
| G6PD | EPR6292 | BD BUV395 | Customized |
| GLUT1 | EPR3915 | AF488 | Customized |
| PRDX2 | EPR5154 | BD BUV615 | Customized |
| ASS1 | EPR12398 | BD AF700 | Customized |
| ATP5A | EPR13030 | AF594 | Customized |
| Surface and intracellular markers | |||
| Antigen | Clone | Fluorochrome | Provider |
| CD4 | SK3 | BV480 | BD |
| CD8 | SKI | BUV805 | BD |
| CD3 | UCTH1 | BB630 | BD |
| H LA-DR | G46-6 | BV786 | BD |
| CDllc | Bly6 | BB700 | BD |
| CD123 | 9F5 | BV650 | BD |
| igM | G20-127 | BUV805 | BD |
| IgD | IA6-2 | BV480 | BD |
| CD19 | HIB19 | BB660 | BD |
| CD16 | 3G8 | BV750 | BD |
| CD14 | M5E2 | PE-Cy7 | BD |
| CD56 | NCAM16.2 | PE-Cy5 | BD |
| CD45 | 2D1 | BUV563 | BD |
| PD-1 | MIH4 | PE | BD |
| ILT3 | ZM3.8 | BV605 | BD |
| CD69 | FN50 | APC-H7 | BD |
| CD86 | 2331/FUN-l | BUV737 | BD |
| live-dead | FVS575V | BV570 | BD |
| CCR7 | G043H7 | BV650 | Customized |
| CD45RA | HI100 | PE | BD |
| CD25 | 2A3 | PE-Cy7 | BD |
| FOXP3 | PCH101 | PE-Cyanine5.5 | Customized |
| CD14 | M5E2 | BV570 | BD |
研究小组筛选了多个代谢途径中的10种关键代谢蛋白，包括限速酶和转运蛋白。对12个供体样本流式数据根据系别标志物和代谢蛋白用BD FlowJo®进行FitSNE降维处理，解析了T、B、NK、DC及单核细胞等11种免疫细胞亚群。通过分析这11种细胞亚群中10种关键代谢蛋白表达量的差异，获取它们的代谢状态。
结果发现pDC细胞表达更高水平的IDH2, ATP5A, G6PD和GLUT1，说明与mDC相比，pDC细胞的氧化磷酸化、TCA循环，PPP途径和葡萄糖摄取能力得到增强；与T细胞、NK细胞相比，B细胞表达更高水平的GLUT1和IDH2,说明B细胞摄取葡萄糖及线粒体氧化磷酸化的能力更强，这与B细胞通过mTOR信号途径活化需要充足能量有关。
可见，Met-Flow可以同时检测不同免疫细胞亚群代谢蛋白的水平以获取它们的代谢状态。
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Met-Flow优势
| - | 细胞代谢检测方法 | 单细胞代谢检测 | 特点 |
| 基于非流式的方法 | Seahorse细胞能量代谢分析仪 | × | 只能检测糖酵解、线粒体呼吸代谢途径的能量变化 ， 无法解决细胞异质性，依赖细胞分选 |
| 代谢检测试剂盒 | × | 只能检测单个蛋白酶活性或者单个代谢产物浓度， 无法解决细胞异质性.依赖细胞分选 | |
| 液相色谱、气相色谱 | × | 能同时检测多个代谢产物浓度 ，无法解决细胞异质性.依赖细胞分选 | |
| 基于流式的方法 | Met-Flow | √ | 灵敏度：比Seahorse高，样本量少，无需分选 |
| 省时：同时检测多种细胞类型代谢水平 | |||
| 多靶点: 同快检测不同代谢途径的代谢变化 |
参考文献：
1：Metabolic Interactions in the Tumor Microenvironment Trends in Cell Biology, Month Year, Vol. xx, No. yy http://dx.doi.org/10.1016/j.tcb.2017.06.003
2：Met-Flow, a strategy for single-cell metabolic analysis highlights dynamic changes in immune subpopulations COMMUNICATIONS BIOLOGY | (2020) 3:305 | https://doi.org/10.1038/s42003-020-1027-9
