1、ball ball了：补偿微球-调补偿神器（点击返回目录）
补偿微球——让调补偿一键搞定的神器
做流式最难最麻烦的是什么？
很多人会说：调补偿。
是的，没错，补偿问题是我们传统多色流式不可避免的问题；
很多人因此不敢去尝试做多色流式，一般做个6色实验就不敢往上做了，白白浪费了一台几十上百万的多通道流式仪，也错过了发高分文章的机会。
那么我们来看看调补偿最常见的问题是什么呢？
Part 1
不会自动调补偿，需要自己手动一个一个去调，费时费力。
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Part 2
想用Flowjo自动调补偿，结果很多通道要么识别不到阳性信号，要么计算得乱七八糟，最后还是需要进一步手动调补偿，还不一定调得好。
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Part 3
细胞样本很少，只够实验管，多色实验的单染管细胞量不够做单染管。如一些珍贵的组织样本或体液：脑组织，肠道组织、肿瘤组织、灌洗液等。
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| 货号 | 用途 | 名称 | 规格 | 备注 |
| 552843 | 补偿微球 | BD™ CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | 6ml | 要求一抗来源是mouse IgG Kappa链 |
| 552844 | 补偿微球 | BD™ CompBeads Anti-Rat Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set | 6ml | 要求一抗来源是rat IgG Kappa链 |
| 552845 | 补偿微球 | BD™ CompBeads Anti-Rat and Anti-Hamster Ig κ /Negative Control Compensation Particles Set | 6ml | 要求一抗来源是hamster和rat IgG Kappa链 |
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Q：抗体的宿主亚型如何看？
A：进入抗体官网，看Isotype这些地方，如下图：宿主就是mouse, “k”就是kappa链的意思。
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如果像上面右图这样的“λ”链的，就不能使用BD的补偿微球啦。
Q：补偿微球怎么使用？
A：非常简单，每个单染管都这样。BD的微球就是把阳性微球和阴性微球各挤一滴混匀，加入0.5ug左右的流式抗体室温避光孵育15min，用PBS洗涤重悬即可（转速250g, 5min，用500uL左右 PBS重悬）。（Thermo的通用型微球是单瓶的，挤一滴即可，其他操作同上。）需要注意的是使用之前都要将微球瓶子充分涡旋，避免微球沉底、挤出来的液滴里没有微球。
Q：关于上机如何调参数的问题？
A：要用空白细胞和微球交替上机调整电压参数，确保所调的荧光通道的电压参数同时适用于细胞样本和微球，优先考虑适用细胞。
细胞直径较大的，微球可以选择plus的。
| 产品编号 | 品名 |
| 560497 | BD™ CompBead Plus Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µm) Particles Set |
| 560499 | BD™ CompBead Plus Anti-Rat Ig, κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µm) Particles Set |
那么问题来了，为什么有的时候用微球做不出来？是抗体有问题吗？还是微球有问题？
这个时候要排除以下几个问题：
1. 抗体的宿主来源是否与微球的反应种属匹配？例如：Rat anti-mouse的某抗体选用了anti-mouse的微球，这是不对的，我们应该选择的是anti-rat的微球。
2. 免疫Ig亚型是否不匹配？BD的微球主要反应的是Ig的Kappa链，如果是lamda链可能就不适合，反应不出来，例如上述Q里的CD25抗体，就是“λ”链的，这种可以选择Thermo的微球（货号：01-2222-42）做。
3. 死活染料用微球染不出来？微球主要应用于抗体单染；死活染料它不是抗体，当然染不出来啦。所以死活染料的单染我们一般用稍微处理一下的细胞做。
还有个小问题就是不管是不是胞内指标，用微球都不需要固定破膜的！
如上问题（包括电压参数等）都排除无误后，还做不出来，那可能真的是抗体问题了。
单染再做不好，知道该用什么了吧？
2、流式对照的实验小结（点击返回目录）
可能很多老师在分析数据的时候都有想过，流式图该把门圈在哪里才比较靠谱？尤其是那些分群不明显的结果，画门位置就是最大的苦恼。
做流式我们知道几种常见的对照：
1.空白对照（未染色细胞）；
2.单阳对照；
3.同型对照；
4.FMO对照；
5.生物对照。
了解这几种对照的正确用法基本可以使流式数据的分析更客观更准确。接下来罗工就和大家聊聊这几种对照的用法↓。
空白对照
作用：作为电压调节的参考，上机调电压的时候先要用空白管上机，调整电压参数使细胞信号在图上各个通道的合适位置；同时也是可以看到细胞的本底信号，圈门时直接排除。
但我们有时候会发现，常规的未染色管（空白对照）似乎不足以帮助我们确定圈门位置，如下图案例展示。这是什么原因呢？
首先，图上空白是未经药物处理的空白细胞，但是高浓度药物很可能会增加细胞的本底荧光信号，如果还按照未处理细胞圈门，可以从分群情况明显看到门不太适用于该样本。这种情况就要注意空白细胞的选择要合适，最好是与实验组经过相同处理的细胞，比如做了固定破膜、加了药物处理等，也就是除了不加抗体，其他处理都一致，这样本底信号的排除才更加准确。
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单阳对照
单阳对照，也就是单染对照。
作用：做单染调补偿是其主要作用，也可以协同调电压，防止阳性信号超出接收范围。
单阳对照，很多老师都有疑惑，我们现在把问题一一罗列出来。
1.做单染的细胞如何选择，可以混合细胞做吗？
2.单染阴性阳性信号分不开？
3.做单染的细胞数量不够？
4.单染调完补偿应用到样本上不适合？
解决上述问题我们首先要了解做单阳管的基本原则。
·单阳细胞阴阳群背景信号要一致，不能混合细胞做单阳；
·单阳信号要要阴阳分群明显，足以判断补偿是否合适；
·单阳染的荧光抗体，荧光要跟样本一致，不能用同通道其他荧光代替；
·单阳收集记录的events数要足够，避免因数据太少导致补偿计算差异太大。
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因此，单阳可以用细胞，也可以用补偿微球（https://fcm.univ-bio.com/article.html?id=3601 ），但是不能混合在一管染，细胞也最好是跟样本接近的类型，不要两种相差很大的细胞混合在一起做（如药物处理和未处理的细胞混合做单阳）; 如果细胞单染阳性分群不明显，可以选择相同荧光素的高表达marker抗体染细胞（如foxp3/AF647用CD8/AF647抗体代替做单染），也可以用补偿微球代替细胞做单染；收集记录的单阳数据至少要5000以上，确保后续补偿值计算的准确性。
同型对照
作为排除背景荧光的对照，试用同型对照可以更准确的排除假阳性，也能帮助验证抗体的特异性。
作用
1.看荧光染料与细胞的结合问题；
2.看抗体FC段与与细胞FCR的结合；
3.看抗体与细胞的其他非特异结合。
举个例子：参考空白圈的会有部分非特异染色，参考同型圈阳性，就把这部分非特异排除了。
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很多验证抗体的特异性也会用同型做QC，比如BD官网的QC图基本都要用同型来做,如下图(图来自BD官网)↓
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或者结合指标抗体与同型抗体一起看某抗体的特异性，如下图看CX3CR1抗体的特异性(图来自流式中文网)↓
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但是，有些时候我们会发现，同型抗体不适用了，因为同型对照的阳性已经比实验管的阳性高了，已经很难判断真正的阳性比例。这个时候我们首先要排除是否选错同型抗体，因为同型抗体的选择有几个基本原则：与目标抗体同宿主来源、同亚型、同荧光素、同蛋白浓度。然后就要看抗体的非特异结合问题。我们来看一下FC段与细胞FCR的非特异结合影响有多大(图来自流式中文网)↓。
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可以看出，IgG1和IgG2a亚型的抗体跟细胞的非特异结合比较强，加了FCR阻断剂之后就好很多，FCR阻断剂可以避免大多数非特异染色，也就是用了FCR之后基本可以不用再做同型对照了。
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FMO对照
对于FMO对照可能很多老师比较陌生，我们在做多色panel的时候，可能会发现一些通道信号特别难看，不好区分，可能就是某个荧光对该通道干扰很大，我们就可以用FMO对照（荧光扣除对照，抗体减一）来找到是哪个荧光的影响，这是它的用途之一；
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另外一个用途就是，可以作为某些指标的阴性对照，排除全染的背景影响，帮助我们更准确地圈门。如下图所示↓。
用FMO去画门会比空白对照画门更加准确，有些分群不明显，或表达不高的的指标都可以做FMO对照去作为画门参考。
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生物对照
这个就是在我们做一些样本处理时就要设置好的Control组，或者增加一些生物指标做参考，来判断实验处理的效果如何。
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做刺激处理的时候为了确定刺激效果，就可以做一下未刺激的对照，看相应的细胞因子检测情况，如下图所示↓。可以去排除一下是刺激剂问题还是抗体染色问题。
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以上就是我们做流式，需要掌握的对照设置问题，做好对照，才能排除分析过程中遇到的各种疑问，分析的结果也会更加客观有效。
3、流式抗体到底应该加多少？（点击返回目录）
Q:罗工，我最近准备开始做流式实验了，可一直有个问题很困扰，就是流式抗体究竟应该加多少才是合适的呢？
Q:我看说明书有的写加5 μl，有的加写20 μl。
Q:可是我问的师兄师姐们，都说加1μl，就是1:100或1:200倍稀释。
Q:我好迷茫啊，抗体加多了感觉经费在燃烧，加少了又担心细胞染不上。
罗工：你刚刚前面提到的几种抗体加样方式，就我个人都是不太推荐的。
罗工：咱不同的待测指标，不同的品牌，不同的荧光素标记，不同的批次，甚至不同的染色环境等都会导致抗体的效价不同。
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Q:感觉越来越复杂了呢，那到底我该咋办呢？
罗工：建议在经费允许的情况下，可以直接按照官方推荐用量实验。
罗工：但想得到最优实验方案和结果，或者单纯的从节省经费的角度考量，还是建议去对咱们购买的每一个抗体进行比较科学的抗体滴定实验进行检测。
Q:这又出来一个新实验，没做过滴定啊！
罗工：抗体滴定很简单的，就像Elisa稀释标准品一样，进行倍比稀释上机检测哪个效果最好就行了！
小A师姐：我们这还有视频教程可以了解下，
https://www.bilibili.com/video/BV13t4y1B7Ch?spm_id_from=333.999.0.0
Q:好嘞，我这就去看看。
另外提醒下哈，咱官方推荐抗体用量时，往往都会着重强调或默认，染色体系为1×10^6细胞/100μl，但细胞数量确实会影响染色质量，要根据固定的染色体系，去摸索抗体浓度哦~
Q:嗯嗯，谢谢罗工，我小笔记都记好了！
参考视频：
4、什么？你说Treg的检测固定破膜太麻烦？（点击返回目录）
你还在为检测Treg细胞中的Foxp3指标需要做固定破膜而烦恼吗？
你还在为破膜效果不佳，Foxp3检测不出来而伤心吗？
看过来：
这里给大家提供一个方便快捷的表染指标来替代FOXP3，
它就是CD127！
虽然CD25+Foxp3+是目前公认的Treg细胞特异性指标，但Foxp3它位于核内，必须固定破膜后才能检测到，操作步骤繁琐，且很容易降解，容易检测不到。
早在2006年，就有文章指出在人样本中CD127的表达与Foxp3的CD4+ Treg细胞表达呈负相关。且相较于Foxp3，CD127是表面指标，不需要固定破膜就可以检测到，在检测Treg细胞上更方便。在临床上，CD127也被用于替换Foxp3去检测Treg细胞。
上证据：
如下图所示，人PBMC中CD127lowCD25+Treg和CD4+FOXP3+Treg比例接近。
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最后插播一句，因为没有足够的文献支持，所以小鼠的Treg暂时还不能用CD127代替FOXP3去检测哦~
| 指标 | 荧光素 | 货号 | 规格 | |
| Human Treg | CD3 | APC-CY7 | 557832 | lOOTst |
| Human Treg | CD4 | BB700 | 566392 | lOOTst |
| Human Treg | CD25 | BB515 | 564467 | lOOTst |
| Human Treg | CD127 | PE | 557938 | lOOug |
| 指标 | 荧光素 | 货号 | 规格 | |
| Mouse Treg | CD3 | FITC | 553061 | lOOug |
| Mouse Treg | CD4 | APC | 553051 | lOOug |
| Mouse Treg | CD25 | BV421 | 564370 | 50ug |
| Mouse Treg | FOXP3 | PE | 563101 | lOOug |
小优可以为您提供，验证过的treg检测骨架panel，欢迎咨询哦：
根据样本来源情况，适当结合CD45（免疫细胞的总marker）和死活染料，效果更佳~
参考文献：
Liu W, Putnam AL, Xu-Yu Z, Szot GL, et al. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. J Exp Med. 2006 Jul 10;203(7):1701-11.
doi: 10.1084/jem.20060772.
5、流式对照的实验小结（点击返回目录）
导言
细胞胞内细胞因子分析方法在持续不断改进中，包括ELISPOT，原位杂交，有限稀释分析等。相比较而言，流式细胞术是一种强大的分析技术，可以同时分析单个细胞的多个参数，包括细胞大小和粒度，以及由荧光抗体表征的细胞表面或胞内标记蛋白的表达。
胞内细胞因子的荧光标记单克隆抗体应用已经非常成熟，也适用于混合细胞群内胞内染色和多色分析。典型应用案例如辅助性T细胞亚群的分析Th1（IFN-γ标记），Th2（IL-4标记），Th17（IL-17a标记）细胞亚群的分析。但很多老师的实验中最大的难题就是细胞因子的标记抗体染色结果不佳，本期总述下实验中常见导致结果不好的原因。
常见原因一：没做细胞的激活
我们平时采到的常规血液或组织样本中，所包含的免疫细胞，多数都是处于静息状态的，没有产生细胞因子，因此无法被检测到。
那我们就需要依靠外界人为的去激活细胞，让其开始分泌细胞因子。或针对已经做过体外诱导培养的样本，再次刺激加强放大细胞分泌因子的能力。
人和小鼠的常见检测细胞因子的刺激方法，可参考下表：
人胞内细胞因子检测刺激方案
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小鼠胞内细胞因子检测刺激方案
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常见原因二：没对分泌蛋白转运系统进行阻断
分泌型的细胞因子，它会伴随着我们的刺激，不停向胞外进行分泌。那我们常规的流式检测对象为细胞，如果细胞因子都分泌出去了，自然就检测不到了，所以为了在细胞中可以检测的到，就需要让这些细胞因子不能分泌出去，实现的方法就是添加蛋白转运阻断剂。
我们最常使用的分泌蛋白阻断剂有两种：
1、阻断高尔基体向细胞膜转运的莫能酶素（Monesin）
2、阻断内质网向高尔基体转运的布雷非德菌素A（BFA）
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为了便于操作，我们经常将刺激和阻断步骤合并，使用市场化的刺激阻断合剂进行一步操作处理：
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常见原因三：固定破膜试剂盒的选择问题10
我们最常用的固定破膜试剂盒有三种，使用第一种专门用于胞膜破膜的试剂盒效果是最好的。那当我们想同时检测Th和Treg细胞时，涉及细胞因子跟foxp3做共染，此时就需要用562574这种核模型试剂盒，只是针对部分实验操作不是很好的老师，核模型试剂盒的使用会对少部分细胞因子的检测存在一定影响。
| 货号 | Description |
| 554714 | BD公司 Cytofix/Cytoperm™ Fixation/Permeabilization Kit |
| 562574 | BD公司 Pharmingen™ Transcription Factor Buffer Set |
| 558050 | BD公司 Phosflow™ Perm Buffer III |
常见原因四：荧光素的搭配选择
前面有讲到一个刺激阻断的步骤，那它呢往往会导致我们某些抗原出现内吞现象的，尤其是小鼠动物模型的CD4，特别明显。因此配色时需去把CD4作为一个弱表达抗原来对待，搭配一些强的荧光进行检测，比如像BB515、BV421这种强荧光素。
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那除了CD4之外，我们其他的T细胞亚型检测时常见标记物的检测也做了一个简单的总结供大家作为一个配色的参考：
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常见原因五：刺激阻断细胞培养体系有误
①细胞数和试剂比例有误
样本制备好的单细胞悬液，在添加刺激阻断剂之前，推荐大家做细胞计数。最好保证每一个孔大概就在1×10^6的细胞，最多不超过3×10^6的细胞。如果细胞数超过，那刺激剂阻断合剂的量正常也是要对应翻倍的。
以BD 货号为550583的刺激阻断合剂为例，培养体系推荐如下：
在48或24孔板的孔内先加1 ml含10%血清的培养基，依次加入2 μl的刺激阻断剂，和计数好的100 μl细胞悬液，放到37℃培养箱中，4~6 h。
②目的细胞的纯度不够高
机体内，可以分泌细胞因子的细胞类型有很多，其中各种免疫细胞和内皮表皮细胞等非免疫细胞，在激活了之后都会分泌细胞因子，其中有些为促炎因子，有些为抑炎因子，互相之间是有一定相互制约性的，因此细胞越复杂，刺激效果就会越差。
比较理想的待测样本为磁珠或流式富集纯化后的目的细胞，或相对来说成分比较简单的PBMC。如果是实质性的脏器组织制备的单细胞悬液，一定要经过Ficoll或Percol试剂纯化后，再进行后续体外刺激激活。
比如为什么很多老师做肿瘤微环境一开始想要做Th1/2/17去刺激的时候，怎么都刺激不出来呢？就是因为他直接拿肿瘤单细胞悬液去刺激了，而我们肿瘤它的整个环境是一个大大的免疫抑制的状态，直接去刺激阻断总的细胞悬液效果肯定不会很好，所以我们一定要注意去对这个细胞尽可能的提纯。
那我们一般做组织的免疫细胞提纯，推荐用40%和80%的Percoll去处理，这样刺激效果会更好的。
详细请参看：
[五小只太难了]第二十四回：Percoll——组织细胞样本免疫细胞纯化神器！
