自然杀伤细胞（natural killer cell，NK），是固有免疫细胞中的重要成员，无需抗原预致敏就能破坏靶细胞，且无MHC限制性，应答速度快，在免疫应答的早期即可发挥作用。最近也有研究显示，NK细胞也能展现部分适应性免疫细胞的一些特性。NK细胞表面不表达多态性克隆型受体，如t细胞受体(TCR)或b细胞受体(BCR)，它们的细胞杀伤功能的激活主要是由识别靶细胞的受体调控的。从外周血中分离出的静息人NK细胞可以在添加人血清的培养基中，体外存活数天，可用于后续研究受外源刺激后，其表型的改变，及其对下游细胞增殖、杀伤等能力的影响。
图1.NK细胞在肿瘤中的“两幅面孔”
△点击放大图片
本文整理了从人外周血中分离NK细胞的方法、体外培养条件以及功能检测的相关方法：
实验前准备：
|
耗材准备 |
试剂准备 |
|
离心管； 磁珠配套的磁力分选架； 细胞计数仪； 96孔板 |
Ficoll； NK磁珠分选试剂盒； 流式鉴定抗体； 人血清，IMDM； 无菌PBS |
第一部分 从人外周血中分离NK细胞
一、PBMC的制备：▲注意：外周血或血沉棕黄层不应超过8h。
1、将15ml Ficoll（Cat:17144002）加至50ml离心管中；
2、离心管倾斜30°，将35ml稀释后的血液沿着管壁轻轻铺在离心管中的Ficoll试剂上，避免液体混合；▲ 注意：用PBS-EDTA缓冲液讲血液体积稀释至2-4倍，血液样本越稀释，PBMC的纯度越好。
3、室温20°C，400Xg离心30-40min；▲ 注意：水平离心机，且应缓升缓降，关闭骤停设置。
4、小心的从离心机中取出离心管，Ficoll分离液和血浆之间的白膜层，即为PBMC；
5、吸弃上清后，将白膜层轻轻地吸出来转移到新的50ml离心管中（多个管中的白膜层可以混在一起）
6、用45ml PBS重悬，室温20°C，300Xg离心10min，重复操作2次，弃去上清；
7、适当的缓冲液重悬，对PBMC进行细胞计数。
二、NK的分选：PBMC制备好以后，采用磁珠分选的方式以达到分离NK的目的，会要用到一些磁珠抗体以及磁力架等产品。具体操作根据自己所需的目的细胞群，购买相关的磁珠产品进行实验即可，都配有非常详尽的产品使用说明书。
常见分选产品如下：
图2.NK细胞的常用分选试剂盒汇总
△点击放大图片
三、NK的流式鉴定：第一次实验操作，建议分选后的细胞，进行NK细胞的活性和纯度的鉴定，避免磁珠操作不当引起的后续实验的不良结果：常规推荐选择 死活染料+CD3-CD56+（or NKP46+）的群体。
分选前 分选后
图3.NK细胞的纯度鉴定
△点击放大图片
第二部分 NK细胞的体外培养
1、重悬 0.5-3 x 10^6 个细胞，在含有 10% HS（人血清）的 100 µL IMDM培养基中 （96 孔板）。
2、用10%HS的IMDM将人IL-15稀释至1µg/mL。加入100µL到步骤1中，即稀释后的人IL-15最终浓度为0.5µg/mL。 ▲注意：此处IL-15为饱和浓度。较低浓度的IL-15或与IL-15其他已知可刺激NK增殖的细胞因子联合刺激均可摸索。如IL-2、IL-15、IL-7、IL-18等单独或组合均能有效地诱导、刺激特定的NK细胞增殖和促进其分化成熟，其中IL-2和IL-15的作用尤为明显。
3、将细胞置于37℃的培养箱培养至少48h(可设置用不含 IL-15刺激细胞作为对照），再进行后续细胞功能鉴定等实验（表型、外源药物刺激、转染、共培养等操作）。
第三部分 NK细胞的功能检测
一、表型鉴定：
图4.NK细胞在不同成熟阶段的圈门策略
△点击放大图片
二、细胞杀伤能力鉴定：
图5.表征人类NK细胞自然杀伤功能的panel
△点击放大图片
三、细胞共培养杀伤能力鉴定：
1、用GFP，CFSE等带荧光的染料去标记NK的靶细胞；
2、将NK细胞与靶细胞的共培养（不同的靶细胞，培养比例梯度和培养时间需要预实验摸索）；
3、收样后，用CD56流式抗体标记NK细胞，结合绝对计数微球，对靶细胞的数量检测，进行统计分析
图6.细胞毒性实验
△点击放大图片
四、细胞因子分泌能力：使用Elisa单指标检测，或CBA,MSD，Luminex等多因子检测方法，检测NK细胞培基上清的细胞因子表达水平。
图7.NK分泌的细胞因子作用
△点击放大图片
参考文献：
[1] Zotto G D , Antonini F , Pesce S , et al. Comprehensive Phenotyping of Human PB NK Cells by Flow Cytometry[J]. Cytometry Part A, 2020, 97(9).
[2] Traba J , Waldmann T A , Anton O M . Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism[J]. Journal of Visualized Experiments, 2020(160).
[3] Lal, Kerri, G, et al. OMIP-027: Functional analysis of human natural killer cells[J]. Cytometry Part A the Journal of the International Society for Analytical Cytology, 2015.
[4] Abel A M , Chao Y , Thakar M S , et al. Natural Killer Cells: Development, Maturation, and Clinical Utilization[J]. Frontiers in Immunology, 2018, 9:1869-.
