一、Human骨髓和脐带血中性粒细胞
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1. 分步样品制备
(1) Human骨髓中性粒细胞
① 在含有ACD-A(酸-柠檬酸-葡萄糖配方A)的肝素生理盐水中收集供体骨髓。
② 用2ml的1倍PBS洗涤样品。4℃，400 × g离心5分钟，丢弃上清。执行单元格计数。
③ 使用500万个细胞，使用纯化的抗人CD16/32 Ab在4°C下阻断fc受体30分钟。加入含抗体的染色缓冲液，4℃孵育30min。
④ 用PBS洗涤样品，4℃，400 × g离心5分钟，丢弃上清。
⑤ 用500 μL 1×红细胞溶解缓冲液溶解红细胞3分钟，洗涤。
⑥ 添加DAPI并获取细胞。
(2) Human脐带血中性粒细胞
① 每100 μL脐带血用1 mL 1 × RBC缓冲液溶解红细胞。室温下孵育6分钟或直到样品变成半透明。
② 用1倍PBS中和。4℃，400 × g离心5min。
③ 使用500万个细胞，使用纯化的抗人CD16/32 Ab在4°C下阻断fc受体30分钟。加入含有抗体的染色缓冲液，4℃孵育30min。
④ 用PBS洗涤样品，4℃，400 × g离心5分钟，丢弃上清液。添加DAPI并获取细胞。
2. Human中性粒细胞检测指标
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3. Human中性粒细胞流式分型检测推荐Panel
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4. 数据分析
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人脐带血中性粒细胞的门控策略。
首先排除双链细胞和死亡细胞，然后排除CD45-细胞。在总粒细胞被CD15和CD66b门控之前，排除谱系细胞和单核细胞。因此，在使用CD11b和CD16对中性粒细胞亚群进行经典命名之前，嗜酸性粒细胞被排除在外。
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Human中性粒细胞的门控策略。作为使用CD11b vs CD16的替代方法人脐带血中性粒细胞总数可分为CD11b-中性粒细胞祖细胞和CD11b+中性粒细胞。增殖的CD11b+ preNeus可以用CD101和CD49d进行分离，如前文所示。如前所述，剩余的非增殖中性粒细胞池可以用CD10分离。
二、小鼠骨髓嗜中性粒细胞
1、分步制样
(1) 用手术刀分离股骨，使髋部球窝关节脱臼。分离连接胫骨的膝盖骨关节。
(2) 清理肌肉组织，切断股骨球以形成一个开口。
(3) 使用1mL注射器和含1mL洗涤缓冲液(PBS +2% FCS + 2mM EDTA)的19号针头，将骨髓从开口冲洗到含有1mL缓冲液的15mL隼管中。吸气，重复两次。从另一端冲洗骨髓。吸气，重复两次。
(4) 用70 μM过滤器过滤悬浮液，去除团块和骨屑。用4mL缓冲液清洗滤网。4°C, 400 × g离心5分钟。
(5) 丢弃上清，用1ml缓冲液重新悬浮颗粒。为了染色的目的，将一部分分离出来。通常四分之一就足够了。
(6) 用缓冲液洗涤和离心样品。丢弃上清，将细胞重新悬浮在50 μL阻断缓冲液中。加入50 μL抗体染色缓冲液，4℃孵育30min。
(7) 加入2ml洗涤缓冲液，离心。丢弃上层清液。
(8) 用200 μL 1x红细胞溶解缓冲液溶解红细胞3分钟。洗。
(9) 重新悬浮在洗涤缓冲液中，在采集前加入DAPI并过滤样品。
2、小鼠中性粒细胞检测指标
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3、小鼠嗜中性粒细胞Panel检测方案推荐指标
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4、数据分析
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流式细胞术分析小鼠骨髓中性粒细胞亚群。
小鼠骨髓样本首先进行门控，以排除双链细胞和死亡细胞。根据前向和侧向散射信息，也排除了碎片。在表达cKithi的细胞中，Ly-6C和CD81被用来标记所有的中性粒细胞祖细胞。CD106区分了前中性粒细胞1和前中性粒细胞2。其他亚群通过首先去除谱系阳性细胞（T、B和NK细胞），然后排除嗜酸性粒细胞和单核细胞来控制。然后使用Ly6C进一步去除任何Ly- 6Chi和Ly-6Clo单核细胞污染。总骨髓中性粒细胞的Gr-1和CD11b门。cKit和CXCR4用于控制增殖前中性粒细胞，CD101可区分成熟中性粒细胞和未成熟中性粒细胞。
三、总结
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