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【多色案例27】30色多色流式细胞术分析急性髓系白血病患者骨髓中免疫检查点抑制标志

Reference:A 30-color panel for analysis of check-point inhibitory networks in the bone marrow of acute myeloid leukemia patients

OMIP是国际流式学会旗下Cytometry PART A杂志中的专栏,全称为:Optimized Multicolor Immunofluorescence Panels。目的是为多色方案的科研人员提供素材,减少其方案的开发时间,提高实验效率。

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急性髓系白血病(AML)是成人最常见的急性白血病。

目前,各种免疫治疗方法,即CAR-T细胞、BiTEs和免疫检查点抑制剂,正在临床试验中进行测试,以延长并提高AML患者的总生存期。

然而,早期的报告显示这些干预措施的益处有限,只对一小部分患者有效,这表明需要基于免疫标记物对患者进行更好的分层。

因此,本文开发并优化了一个30色面板,用于评估效应免疫细胞(NK细胞,γδ T细胞,nkt样T细胞和经典T细胞)浸润骨髓,并分析其分化,表达抑制(PD-1, TIGIT, Tim3, NKG2A)和激活受体(DNAM-1, NKG2D)的表型。

并通过分析PD-L1、CD112、CD155和CD200等抑制配体的表达来评估CD33+骨髓细胞、CD34+CD38-和CD34+CD38+造血干细胞和祖细胞的免疫表型。

 

基础信息

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流式方案

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流式结果

急性髓系白血病(AML)骨髓样本(BM 1)的门控分析。在手动门控之前,使用FlowAI算法进行质控。

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(A)首先,进行清除门控,清除碎片、粘连体、死亡细胞和CD45阴性细胞。

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(B)在CD45+细胞中圈出T细胞。CD3+细胞被分离为γδTCR+ T细胞和γδTCR- T细胞,并进一步形成亚型。γδTCR- T细胞根据CD56的表达分为CD56+CD3+ NKT-like细胞,代表iNKT细胞和高度激活的T细胞,以及CD3+CD56-经典T细胞。在所有已鉴定的亚型中,我们进一步鉴定了CD4和CD8的表达。在经典的γδTCRCD56-CD3+CD4+ T细胞中,我们鉴定了CD25+FoxP3+Treg和CD4+CD25+/-FoxP3-效应T细胞(非treg)。treg被进一步分型为CD39-treg和高度抑制激活的CD39+treg。在所有亚群中,确定了基于CD45RO和CD62L的分化图谱,以识别TCM、TEM、TEFF和由幼稚干细胞和记忆干细胞组成的异质群体TN_TSCM。

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(C)绘制CD33/CD56图谱并选择CD56+CD33-细胞,NK细胞在CD3-亚群中进行门控。随后,使用清除CD45hi门去除污染的髓系细胞,包括SSC增加的活化NK细胞。最后,鉴定出CD56hi和CD56lo NK细胞。

(D)为了鉴定成髓细胞和HSPCs,使用放置在CD45lo细胞上的门,排除了CD33 vs CD45图上剩余的成熟CD45hi白细胞。后通过门控CD33和CD34,鉴定了CD45loCD33+成髓细胞和CD34+HSPCs。CD34+HSPCs根据CD38的表达情况分为两个亚群。由于患者样本中CD38的表达高度可变,因此使用FMO对照来设置CD38+和CD38-细胞的门。

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(E)在患者样本中,TIGIT和Tim3的含量较低;因此,使用抗cd3抗体刺激3天,分析TIGIT和Tim3的表达。门是基于FMO设置的。

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(F)直方图显示不同T细胞和NK细胞不同亚群中抑制和激活分子的表达。

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(G)由于成髓细胞和AML(BM1-4)中标记物的表达高度可变性,单个共抑制配体和共刺激配体在HSPCs上的表达描绘了不同的患者样本。门是基于FMO设置的。

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(H)以直方图显示在患者BM1的成髓细胞和HSPCs亚群上表达的免疫调节分子。由于AML中共抑制性受体和抑制性配体的表达是高度可变的,无法识别出所有标记物都呈阳性的患者。必须对一些患者进行筛查以观察阳性表达。

如前所述,抗白血病反应的结果不仅取决于免疫效应物的特性,还取决于白血病细胞在免疫过程中形成的防御机制。包括了免疫抑制受体、共刺激受体和外酶CD39的配体来形成这些特性。

在抑制性受体配体中,PD-L1是研究最多的,其他抑制配体是CD112 (PVRL2)和CD155 (PVR)。这些配体在AML母细胞上广泛表达,并已被证明通过与TIGIT的相互作用来抑制NK细胞的细胞毒性。此外,单独抑制TIGIT信号通路或联合抑制核苷三磷酸二磷酸水解酶(NTPDase)CD39可以促进NK细胞介导的对AML细胞的细胞毒性。

CD200AML细胞表达的另一个重要的抑制性配体。CD200被认为是LSC的标志物,在抑制NK细胞和T细胞中起重要作用。

CD200也被证明是一种与核心结合因子AML中较低的总生存率相关的阴性预后标志物。另一种由AML细胞表达的抑制性配体是CD276(B3-H7)。CD276在AML中的作用仍在研究中。最近的报告表明,因为免疫逃避的作用,CD276(B3-H7)高表达与不良结果相关。此外,使用阻断单克隆抗体的实验改善了NK细胞介导的AML细胞裂解。

AML细胞也表达共刺激分子。其中,CD275(ICOS-L)已被认为是一种促进Treg分化和扩张的免疫逃逸分子。CD86是一种共刺激分子,对免疫反应很重要。然而CD86也可以通过CTLA-4传递信号,抑制t细胞反应。在AML中,已观察到CD86表达与免疫浸润之间的关联。

 

综上所述,本panel适用于评价AML母细胞的免疫逃逸机制和对效应免疫细胞的抑制。它是用骨髓样本设计的,但同样也适用于外周血