【小优细节君】P65磷酸化如何刺激？文献来解答！

小优细节君在整理过去一年的咨询时发现问的最多的还是老牌转录因子P65的磷酸化，其中绝大部分问题都是无条带。而检测P65磷酸化最最关键的就是诱导方式了，于是细节君就想知道文献中都是怎么刺激的。话不多说，马上行动，在查阅了一些文献后（大概300篇，主要关注细胞实验，因为动物实验较难重复），发现了以下有趣的数据，和各位小伙伴分享一下。

细胞模型
使用最多的细胞是RAW264.7（小鼠单核巨噬细胞白血病细胞），是常用的炎症细胞模型之一，而NFκB和炎症密切相关，使用RAW细胞作为模型也理所应当。其次是BMM/BMDM（骨髓巨噬细胞），THP-1（人单核细胞白血病细胞），BV2（小鼠小胶质细胞）等。总体上可以分为三类，一是巨噬细胞，二是肿瘤细胞，三是正常细胞，其中巨噬细胞是最多的。

 

图1 检测p-p65使用的细胞模型比例
△点击放大图片

刺激物
使用的最多的刺激物为LPS（脂多糖），LPS是革兰氏阴性细菌细胞壁外壁的组成成分，通过TLR4来激活NFκB信号通路。其次是TNFα，IL-1β这类炎性因子，接下来是诱导分化的RANKL，PMA，CXCL14，还有一些是双氧水，高糖等处理。

 

图2 检测p-p65使用的刺激物比例
△点击放大图片

M1巨噬细胞诱导
从上面两张图可以看出，巨噬细胞+LPS/TNFα是最常用的搭配组合，可以联想到目前研究很多的M1促炎巨噬细胞，M1分化意味着NFκB信号通路的激活和P65的磷酸化。所以当我们有时不确定自己的刺激方式是否合适时，增加一个M1阳性对照，就可以排查问题了。

 

图3 巨噬细胞分型及对应刺激和marker
△点击放大图片

LPS刺激条件
有小伙伴要问，实验室有LPS，但是不知道使用浓度和刺激时间。别急，小优细节君整理了文献中LPS的使用浓度和刺激时间，包含了多种细胞，可以参考：
 

图4 LPS的刺激浓度和时间分布图
△点击放大图片

在做这张图之前，小优细节君认为按照常理，刺激浓度越高，刺激时间会相应短一些。但实际结果却出乎意料，短时间，低浓度的LPS也足以诱导P65的磷酸化，而高浓度的LPS刺激时间不减反增。不过这和研究者的细胞模型、实验方案密切有关，像巨噬细胞这类，可能低浓度短时间的刺激就完全足够了，而正常细胞可能需要更高浓度和更长时间的诱导。

从上图可以看出，对于不同的细胞，LPS刺激的浓度和时间均有较大的跨度，浓度范围从10ng/ml-10ug/ml，时间从10min到48h。从频率看，最常用的LPS浓度是100ng/ml和1ug/ml，时间是24h，那么在不确定细胞类型的情况下，我们就可以把这个作为摸索最佳刺激条件的起始条件。

肿瘤细胞
另外，我们还发现一些肿瘤细胞系，本底就有P65磷酸化的表达。因为NFκB可以诱导细胞增殖和抗凋亡基因表达，并增加血管新生，所以很多研究者把NFκB活化作为癌症标志之一。有一些研究报道，敲除IKK后可以抑制肿瘤的发生发展，所以对于动物肿瘤模型，我们大概率是可以观察到P65的磷酸化的，不过对于所有肿瘤细胞系，目前还不能一概而论，还需要具体分析。

实验细节
我们知道如何诱导细胞了，那就成功一半了，小优细节君再分享一下其他需要注意的小细节：

1、制样时裂解液务必添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，增加超声处理，充分裂解样本。

2、磷酸化容易降解，尽量使用新鲜样本，全程低温操作。

3、封闭液可以使用5%脱脂奶粉，一抗稀释液建议使用5%BSA。

4、磷酸化的P65既存在于胞浆，也可能会进入核内，如果需要分开分析，需要制备胞浆胞核裂解液。

 

推荐产品助力您的实验：

推荐阅读：
【小优细节君】偶遇Caspase提问器
【小优细节君】 炎症小体NLRP3如何做好？