CD4+Th亚群
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在进行如上Th细胞亚群检测时，如TH1: CD4+IFN+, TH2: CD4+IL-4+, TH17:CD4+IL-17+，通常使用的胞内流式检测Intracellular staining (flow cytometry)，一般实验流程workflow如下：
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1、CD4表达异常？上演消失术？
l 胞内细胞因子检测，需要用佛波脂(Phorbol 12-myristate 13-Acetate，PMA)和离子霉素(Ionomycin，Ion)等在体外短暂培养刺激T细胞
l 继而加入布雷菲德菌素(Brefeldin A，BFA)或莫能菌素( Monensin)等蛋白转运抑制剂来阻断合成的细胞因子释放到细胞外
l 但PMA刺激后，会引起CD4表面抗原的内吞和表达下调，导致后续流式检测较难区分CD4+和CD4-T细胞。
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Peripheral blood lymphocytes (PBL) from four normal horses and purified peripheral blood CD4 cells were pre-incubated in the presence or absence of PMA at 37 °C for 4 h, and then analyzed for the CD4 expression by flow cytometry using a monoclonat antibody to equine CD4 molecules (WS 72 ).
2、CD4表面抗原表达下调，是因为细胞的内吞
l PMA刺激使得CD4胞质区的丝氨酸残基磷酸化，在亮氨酸残基存在的情况下，招募衔接蛋白AP-2复合体，在与分类信号相互作用，启动网格蛋白包被着CD4形成包被小凹
l PMA增加了网格蛋白包被中的CD4的聚集，从而增加了CD4内吞作用的速率
l 包被小凹经过内陷和溢缩后出现包被液泡(coated vesicle)，包被液泡最后通过芽殖和和脱壳完成CD4的内吞过程
3、是不是所有样本的CD4都会上演消失术
样本：Sub T1、 MOLT－3、人外周血淋巴细胞、小鼠胸腺细胞、AKR 1G1、小鼠外周血淋巴细胞
刺激剂：5 ng/mL～500 ng/mL PMA
方法学：观察6种样本给与不同浓度的PMA刺激后，通过流式检测CD4表达变化差异
结论：Sub T1、 MOLT－3、人外周血淋巴细胞、小鼠胸腺细胞、AKR 1G1这五种细胞在PMA刺激后，CD4均出现明显内吞，但小鼠外周血淋巴细胞中CD4表达变化不明显
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文章：Michael Bigby. Phorbol myristate acetate-induced down-modulation of CD4 is dependent on calmodulin and intracellular calcium. The Journal of Immunlogy, 1990, 144:3111-3116
建议解决方案
解决方案一：CD3+CD8-反圈门
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解决方案二：给CD4换亮的荧光通道
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BV421亮度：Very Bright非常亮
FITC亮度：Moderate中等偏弱
解决方案三：换为表面Marekr染色
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