学会这些招,组织Tissue单细胞悬液制备不再难

一、组织的组成

△点击放大图片

组织解离的方法

△点击放大图片

△点击放大图片

参考文献：Best Practices for Preparing a Single Cell Suspension from Solid Tissues for Flow Cytometry doi:10.1002/cyto.a.23690.

二、什么是高质量的样本制备？

△点击放大图片

参考文献：《流式细胞仪配套用检测试剂注册技术审查指导原则》

哪些因素会影响细胞数量？

1、不同消化方案得到不同细胞数量

方法1.Collagenase D and  Dispase Tissue Digestion

△点击放大图片

方法2:Collagenase D and Collagenase P Tissue Digestion

△点击放大图片

2、离心速度

△点击放大图片

a)选择RCF而非RPM

b)使用聚丙烯管（减少细胞黏附）

c)用宽口的枪头

d)均匀的速度

e)避免产生气泡

3、离心幅度

△点击放大图片

√  提篮式离心机（适当降低降速幅度），可以减少细胞的丢失（离心后细胞沉淀聚集在离心管底部），降速时不易破坏细胞沉淀

△点击放大图片

√  固定角度的离心机会在降速时破坏细胞沉淀，造成细胞丢失（但优点是细胞沉淀固定在一角，方便吸取更多的上清）

细胞量预估

△点击放大图片

哪些因素会影响细胞活性？

1、冻存组织与新鲜组织有多大差别？

△点击放大图片

参考文献：Best Practices for Preparing a Single Cell Suspension from Solid Tissues for Flow Cytometrydoi:10.1002/cyto.a.23690.

2、酶的选择问题

△点击放大图片

四种不同的消化酶处理小鼠黑色瘤组织样本：Single cell suspensions of melanomas were prepared using distinct enzymatic treatments and cell viabilities were determined by flow cytometric analysis. 得到的细胞数量和活性有较大差异

3、敏感的抗原会上演消失术

△点击放大图片

为什么要加入DNASE酶？

l 组织消化时，机械剪切或酶解会导致细胞破裂，释放基因组 DNA。DNA 分子的粘性会使溶液变得粘稠，阻碍单细胞分离。

l 游离 DNA 可通过静电作用桥接细胞，形成细胞团块。DNASE 破坏这种桥接作用，减少团聚，提高单细胞得率。

l 浓度：通常使用10-100 µg/mL的DNase I

l 时间：消化过程中加入，作用10-30分钟

l 终止：可通过EDTA或加热灭活DNase酶

三、质控是必须要做的

△点击放大图片

小而美的产品推荐：组织解离试剂盒

不想反复摸索酶浓度、降低摸索时间、降低试错成本、降低焦虑

 

小而美的产品推荐：细胞筛网（Cell strainer）