实验整体workflow
△点击放大图片
实验思路
| 步骤 | 关键内容 |
| 目标 | 通过流式细胞术分析小鼠不同组织（耳、脑、肺、肝、脾等）中的髓系细胞（巨噬细胞、树突状细胞、粒细胞等）。 |
| 实验 流程 |
1. 样本采集：麻醉小鼠，采集血液、腹腔灌洗液及各组织（耳、脑、脾、肝等）。 2. 组织处理：使用酶解（Collagenase IV、Dispase）消化组织，制备单细胞悬液。 3. 抗体染色：根据组织特异性抗体组合染色，区分不同髓系细胞亚群。 4. 数据分析：通过流式细胞仪采集数据，基于标记物（如CD45、CD11b、F4/80等）设定门控策略。 |
| 关键 策略 |
- 使用负向标记（Lineage标记）排除淋巴细胞和中性粒细胞。 - 正向标记（如CD11c、MHCII）定义目标细胞群。 - 不同组织需特异性抗体组合（如脑微胶质细胞需CD45int、F4/80+）。 |
小鼠组织样本制备实验步骤整理
一、样本采集（Sampling）
时间：30分钟
1. 麻醉与处死
o 腹腔注射250 μL 0.9%戊巴比妥钠麻醉小鼠。
o 心脏穿刺采血，转移至抗凝管中，用ACK裂解液（1×）处理红细胞。
o 颈椎脱臼法处死小鼠。
2. 腹膜灌洗
o 腹腔注射5 mL含2 mM EDTA的PBS，轻柔按摩腹部2分钟。
o 回收灌洗液，离心后重悬于FACs缓冲液，冰上保存。
3. 全身灌注
o 左心室灌注10 mL PBS，彻底清除血液（直至流出液清澈无红细胞）。
4. 器官采集
o 取肺、脾、肝（一叶）、肾（单侧）、结肠、小肠、双耳及半脑，置于含PBS的培养皿中，冰上保存。
二、器官处理（Processing the Organs）
时间：4小时
1. 耳部皮肤（Ear）
· 分离耳部背侧和腹侧皮肤，加入1 mL Dispase溶液，37℃消化90分钟。
· 消化后分离表皮和真皮，分别剪碎后加入消化液（Collagenase IV + DNase I），37℃消化60分钟。
· 针头机械解离，过70 μm滤网，离心后重悬于FACs缓冲液。
△点击放大图片
2. 脾脏（Spleen）
· 将脾脏置于70 μm滤网上研磨，PBS冲洗。
红细胞裂解（ACK裂解液处理5分钟），离心后重悬于FACs缓冲液。
△点击放大图片
3. 脑（Brain）
· 剪碎脑组织，加入消化液（Collagenase IV + DNase I），37℃消化60分钟。
· 针头机械解离，过70 μm滤网，离心后重悬于40% Percoll。
· 梯度离心（80% Percoll底层，40% Percoll上层），收集界面层细胞，重悬于FACs缓冲液。
4. 肺、肝、肾（Lung, Liver, Kidney）
· 剪碎组织，加入消化液（Collagenase IV + DNase I），37℃消化60分钟。
· 针头机械解离，过70 μm滤网，红细胞裂解后重悬于FACs缓冲液。
△点击放大图片
5. 肠道（Gut）
· 去除脂肪组织和Peyer’s patches。
· 纵向切开肠道，剪成0.5 cm片段，PBS洗涤4次。
· 5 mM EDTA + 2 mM DTT处理20分钟（37℃振荡），去除上皮细胞。
· 剩余组织剪碎后消化（Collagenase IV + DNase I，37℃ 60分钟），过70 μm滤网，重悬于FACs缓冲液。
三、指标选择与圈门逻辑
小鼠外周血-指标选择
△点击放大图片
小鼠脾脏-指标选择
△点击放大图片
小鼠外周血和脾脏（peipheral, spleen）圈门逻辑
△点击放大图片
外周血和脾脏中髓系细胞的流式设门策略
（A）8 周龄小鼠外周血中淋系和髓系细胞的设门策略。
（B）8 周龄小鼠脾脏中浆细胞样树突状细胞（pDCs，Lin⁻B220⁺CD172a⁺）、常规树突状细胞（cDCs，Lin⁻B220⁻F4/80⁻CD11c⁺MHCII⁺）和巨噬细胞（Lin⁻B220⁻F4/80⁺CD11b⁺）的设门策略。谱系标记物（Lineage markers）包括 CD3e、CD19、CD49b 和 Ly6G。
小鼠肺脏和大脑
△点击放大图片
小鼠上皮
△点击放大图片
小鼠肝脏-指标选择
△点击放大图片
小鼠大脑、上皮、肝脏（brain, epidemis, liver）-圈门逻辑
△点击放大图片
脑、表皮和肝脏中髓系细胞的流式设门策略
（A）8周龄小鼠脑内microglia细胞（CD45ⁱⁿᵗCD11b⁺F4/80⁺Ly6C⁻）的设门策略。
（B）8 周龄小鼠表皮Langerhans细胞（CD45⁺Ly6G⁻Siglec F⁻CD11b⁺F4/80⁺）的设门策略。
（C）8 周龄小鼠肝脏kupffer细胞（CD45⁺Lin⁻CD11b⁺F4/80⁺Tim-4⁺）的设门策略。谱系标记物（Lineage markers）包括 CD3e、CD19、CD49b 和 Ly6G。
小鼠腹腔灌洗液
△点击放大图片
小鼠肾组织和表皮、肠道
△点击放大图片
小鼠肺组织、腹腔灌洗液、肾组织(lung, pertioneal lavage, kidney)圈门逻辑
△点击放大图片
肺、腹腔灌洗液和肾脏中髓系细胞的流式设门策略
（A）8 周龄小鼠肺组织中肺泡巨噬细胞（AMs，CD45⁺Ly6G⁻Siglec F⁺）、间质巨噬细胞（IM，CD45⁺Ly6G⁻Siglec F⁻F4/80⁺Ly6Cˡᵒ）和树突状细胞（DCs,CD45⁺Ly6G⁻Siglec F⁻F4/80⁻CD11c⁺MHCII⁺）的设门策略。
（B）8 周龄小鼠腹腔灌洗液中腹腔巨噬细胞（CD45⁺Ly6G⁻Siglec F⁻CD11bʰⁱF4/80ʰⁱCD115⁺Ly6C⁻）和树突状细胞（DCs，CD45⁺Ly6G⁻Siglec F⁻F4/80⁻CD11c⁺MHCII⁺）的设门策略。
（C）8 周龄小鼠肾脏中肾脏巨噬细胞（CD45⁺Ly6G⁻Siglec F⁻CD11b⁺F4/80⁺
MHCII⁺Ly6C⁻）和树突状细胞（DCs，CD45⁺Ly6G⁻Siglec F⁻F4/80⁻CD11c⁺MHCII⁺）的设门策略。
小鼠真皮组织、肠道组织（dermis,gut)圈门逻辑
△点击放大图片
真皮和肠道中髓系细胞的流式设门策略
（A）8 周龄小鼠真皮中MHCII⁺巨噬细胞(CD45⁺ Ly6G⁻ Siglec F⁻ CD11b⁺ CD24⁻ F4/80⁺ CD64⁺ MHCII⁺）和 MHCII⁻巨噬细胞(CD45⁺Ly6G⁻Siglec F⁻CD11b⁺CD24⁻F4/80⁺CD64⁺MHCII⁻）的设门策略。
（B）8 周龄小鼠肠道中巨噬细胞（CD45⁺Ly6G⁻Siglec F⁻CD11b⁺CD64⁺CD11cⁱⁿᵗMHCII⁺Ly6C⁻）的设门策略。
参考文献
https://doi.org/10.1016/j.xpro.2020.100029
